中国生物制品学杂志

2017, v.30(09) 901-905

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用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备
Preparation of specific green fluorescent fusion protein for determination of activity of botulinum toxin

吉元刚;张国利;李泽鸿;岳玉环;吴广谋;田园;刘雨玲;李玉洁;赵鑫;付玉和;王冬冬;张培培;侯天全;徐艳玲;马洪园;

摘要(Abstract):

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。

关键词(KeyWords): SNAP25-VAMP;绿色荧光蛋白;肉毒毒素活性;血清型

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 吉林省科技发展计划资助(20130206012yy)

作者(Author): 吉元刚;张国利;李泽鸿;岳玉环;吴广谋;田园;刘雨玲;李玉洁;赵鑫;付玉和;王冬冬;张培培;侯天全;徐艳玲;马洪园;

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DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.001785

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