- 李秀玲;王潇潇;张中洋;郝春生;张晨;何薇薇;
目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。
2010年01期 v.23 1-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 365K] [下载次数：397 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 石碧珠;张华捷;孟民杰;张庶民;
目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。
2010年01期 v.23 9-12页 [查看摘要][在线阅读][下载 404K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李静;俞永新;董关木;安祺;杨立宏;孔艳;景川;
目的在获得乙型脑炎病毒(JEV)全长cDNA分子的基础上,建立感染性转录体,获得恢复病毒,为JEV致病机理、疫苗研制及分子病毒学研究提供方法。方法将全长JEV cDNA分子克隆入改造后的pBluescript KS I(I+)载体上,经T7启动子体外转录,在Lipofectamine2000介导下,将转录产物转染入BHK-21细胞,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验鉴定恢复病毒。结果转录产物转染BHK-21细胞后,观察到明显的细胞病变;收获恢复病毒,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验证实为JEV。结论已建立了JEV全长cDNA克隆经体外转录获得JEV感染性RNA的方法,为JEV分子生物学及疫苗研究等奠定了基础。
2010年01期 v.23 13-16+21页 [查看摘要][在线阅读][下载 323K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 喻刚;杨京生;全家妩;
目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。
2010年01期 v.23 17-21页 [查看摘要][在线阅读][下载 730K] [下载次数：111 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨梅;沈薇;吴进峰;曾贵利;王峰;任红;唐开福;
目的研究ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响,探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用。方法将ALU全基因序列插入pcDNA3.1(-)载体的CMV启动子(一个RNA聚合酶Ⅱ启动子)的下游,构建重组质粒pcDNA3.1-ALU;转染HEK293细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR筛选稳定表达ALU的细胞;用干扰素处理稳定表达ALU序列的细胞,Western blot法检测PKR的磷酸化水平。结果ALU全基因序列插入pcDNA3.1载体的CMV启动子直接下游,能够被RNA聚合酶Ⅱ有效转录;在稳定表达ALU的HEK293细胞中,加干扰素与未加干扰素组PKR的磷酸化水平均明显高于相应的HEK293细胞对照组。结论ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录无明显影响,但与RNA聚合酶Ⅲ启动下转录的ALU不同,RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU失去了对干扰素的拮抗作用,反而可以通过形成双链RNA的方式激活PKR的活性。
2010年01期 v.23 22-24页 [查看摘要][在线阅读][下载 301K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 王丽春;廖芸;龙润乡;王晶晶;刘龙丁;陈纪军;李琦涵;
目的探讨泽泻提取物中提取的萜类衍生物单体V-54对小RNA病毒感染增殖的抑制效应及其生物学机理。方法采用KMB17细胞,分别感染HAV-H、PV-Ⅰ和Cox-B2病毒,经V-54处理后检测病毒滴度,分析PV-Ⅰ和Cox-B2病毒增殖抑制的动力学及V-54对KMB17细胞凋亡的影响。结果V-54可抑制3种病毒在KMB17细胞上增殖,PV-Ⅰ和Cox-B2病毒感染滴度比未处理组明显降低,V-54对两种病毒的抑制作用呈剂量依赖性。作用24h内,V-54可使KMB17细胞凋亡率明显增加,随后逐渐恢复正常。结论V-54可抑制特定的小RNA病毒的感染增殖,其机制可能为V-54分子结合到细胞表面的相关受体,导致病毒感染效率降低。
2010年01期 v.23 25-27页 [查看摘要][在线阅读][下载 359K] [下载次数：218 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 牟丽;曾丽玲;张小虎;黄民;赵华;
目的观察缰核损毁对下丘脑内GABAA受体α1亚单位(GABAAα1)表达的影响,以揭示缰核与下丘脑之间功能联系的可能的分子机制。方法建立缰核损毁大鼠模型,以假手术组为对照。分离下丘脑,提取总RNA及总蛋白,采用RT-PCR和Western blot方法检测两组大鼠下丘脑内GABAAα1 mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果缰核损毁大鼠下丘脑内GABAAα1 mRNA的转录水平及蛋白表达水平均明显高于假手术对照组。结论缰核损毁可显著提高下丘脑内GABAAα1的表达水平,提示GABAA受体可能在缰核与下丘脑共同参与的生理调节过程中起重要作用。
2010年01期 v.23 28-29+35页 [查看摘要][在线阅读][下载 228K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张滨;马美湖;
目的分离纯化血红素肽-铁,并分析其清除自由基的能力。方法以聚丙烯酰胺为载体,对利用真空及低压高频脉冲胰蛋白酶降解猪血红蛋白的产物进行金属螯合亲和层析分离纯化,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)及生物信息学网站分析血红素肽-铁的分子结构;以维生素C(Vc)为对照,分析血红素肽-铁的抗氧化能力;以邻苯三酚法分析血红素肽-铁清除超氧阴离子的能力;以脱氧核糖法分析血红素肽-铁清除羟基自由基(·OH)的能力;以三氯甲烷-甲醇法分析血红素肽-铁对脂质过氧化的抑制作用。结果分离纯化的血红素肽-铁由139个氨基酸组成,相对分子质量为16065.08,铁离子含量为11013.5μg/L,理论pI为8.10,消光系数为6990,脂肪系数为92.73,不稳定系数为1.18,总平均疏水性为-0.023;在体外具有较强的清除超氧阴离子和抗氧化自由基能力。结论分离纯化的血红素肽-铁具有清除自由基的能力。
2010年01期 v.23 30-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 805K] [下载次数：281 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 陈玉丙;王洪艳;刘丽萍;龚守良;宋祥福;张红梅;林英;
目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对电离辐射诱发的小鼠胸腺瘤的抑制作用。方法采用经典Kaplan法复制电离辐射诱发的小鼠胸腺瘤模型。应用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠MSCs,DAPI标记,经尾静脉注入荷瘤小鼠后,分别于1、5、10d处死小鼠,取胸腺组织,激光共聚焦显微镜下观察MSCs在胸腺瘤组织中的定位;第1次全身大剂量照射后6个月取胸腺组织,HE染色观察胸腺组织的病理变化,并判断成瘤情况。结果激光共聚焦显微镜下观察可见,MSCs经尾静脉输注后可迁徙至小鼠胸腺组织内;病理观察显示,胸腺组织皮髓质结构清楚,淋巴样肿瘤细胞较少,细胞形态、大小不一,偶见核分裂象;MSCs输注使辐射诱导的胸腺瘤成瘤率由57.00%±9.78%降低至37.50%±7.55%。结论已成功建立辐射诱发的小鼠胸腺瘤模型;输注的MSCs可迁徙至胸腺组织中,并降低胸腺瘤的成瘤率。
2010年01期 v.23 36-38+50页 [查看摘要][在线阅读][下载 367K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 傅泳航;杨向阳;李茹冰;王增松;王翠玲;谢飞群;牛丽红;邓凤君;徐江平;张宜俊;
目的探讨绿脓杆菌及其鞭毛蛋白联合rhIL-12体外对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响,为rhIL-12作为佐剂应用于临床提供理论依据。方法取健康人及慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs),分别与绿脓杆菌、鞭毛蛋白、rhIL-12、绿脓杆菌+rhIL-12、鞭毛蛋白+rhIL-12孵育,ELISA法检测细胞培养上清中IFNγ的含量。结果绿脓杆菌和鞭毛蛋白组只诱导产生低水平的IFNγ,rhIL-12组诱导产生IFNγ的水平较阴性对照组显著提高;而绿脓杆菌+rhIL-12组、鞭毛蛋白+rhIL-12组诱导产生IFNγ的水平显著高于绿脓杆菌、鞭毛蛋白和rhIL-12组,差异均有统计学意义,且rhIL-12的作用呈剂量依赖性。结论绿脓杆菌及其鞭毛蛋白联合rhIL-12体外能显著提高健康人和慢性乙型肝炎患者PBMCs产生IFNγ的水平,增强其细胞免疫应答。
2010年01期 v.23 39-42页 [查看摘要][在线阅读][下载 415K] [下载次数：184 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 马忠辉;赵巧香;高新;王诗鸿;宋海峰;杨焕民;
目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。
2010年01期 v.23 43-46页 [查看摘要][在线阅读][下载 643K] [下载次数：342 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ]
- 吴瑜;冯建平;林林;吴雪伶;孟淑芳;王佑春;李德富;
目的采用STR图谱分析法鉴别人源细胞交叉污染。方法采用PCR-毛细管电泳分析方法,分别检测人源、猴源及鼠源细胞以及人源细胞交叉污染模型的16个STR位点,分析STR图谱法用于细胞交叉污染检测的可行性。并对来自不同生物制品生产单位的27株生产用细胞及5株组织工程医疗产品用细胞进行STR图谱分析。结果STR图谱分析方法具有人源细胞特异性,猴源细胞及鼠源细胞不产生特征性图谱。此方法可以对形态相似或不相似的人源细胞交叉污染模型进行明确鉴别。采用此方法检测的27株生物制品生产用人源细胞未发现有交叉污染现象,而5株组织工程医疗产品用细胞中,发现有2株为非单个个体的混合细胞。结论STR图谱分析法具有高特异性,可用于人源细胞间交叉污染或细胞个体来源的鉴别。
2010年01期 v.23 74-78+86页 [查看摘要][在线阅读][下载 896K] [下载次数：819 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 张琛;张瑛;郭峰;李春如;应明;白杨;王龙飞;
目的利用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰中性蛋白酶,并考察修饰酶的酶学性质。方法采用氰脲酰氯对mPEG5000进行活化,再对中性蛋白酶进行化学修饰,制得mPEG-中性蛋白酶,并比较中性蛋白酶在修饰前后的红外光谱和酶学性质。结果中性蛋白酶的修饰率为41.7%;红外光谱分析表明,修饰酶红外光谱图的多处特征峰有较大的改变;其最适温度和最适pH值未发生变化,但修饰酶的热稳定性显著提高。结论确定了经mPEG化学修饰中性蛋白酶的最适温度和最适pH值,获得的修饰酶热稳定性高于天然酶。
2010年01期 v.23 79-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 422K] [下载次数：364 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 程立均;魏敬双;张世雄;李耿;贾茜;
目的对重组单抗药物的非还原电泳纯度进行分析,排除样品制备过程中形成的一些假象。方法结合重组单抗的分子结构特征,改变常规SDS-PAGE条件,将抗体样品在不同的缓冲液及电泳条件下进行比较。结果抗体在非还原SDS-PAGE纯度检测中出现的次带,可通过在供试品缓冲液中加入烷基化试剂封闭自由巯基而几乎全部消除;通过降低电泳过程的环境温度,可有效降低主带上方高相对分子质量带的出现。结论单抗药物中由于含有多对二硫键引起的一些因电泳样品制备而形成的假象带,可以通过试验方法的修正而去除。
2010年01期 v.23 83-86页 [查看摘要][在线阅读][下载 399K] [下载次数：747 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 贾卉;蔡芳;高强;张建三;井申荣;
目的建立EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于EV71灭活疫苗生产过程中抗原含量的检测。方法采用EV71全病毒免疫,制备抗EV71单克隆抗体及多克隆抗体,以抗EV71多克隆抗体作为包被抗体,经HRP标记的抗EV71单克隆抗体作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测样品中EV71抗原含量,并对该方法进行验证及应用。结果所建立的方法线性范围为5～80U/ml,R2=0.994,线性关系良好,定量限度为5U/ml;检测不同浓度的EV71抗原内部参考品,回收率为88%～119.0%;变异系数均小于15%;与甲肝病毒收获液、乙脑病毒灭活液、H5N1流感病毒裂解疫苗原液、小牛血清、人白蛋白、Vero细胞、MEM培养基及CoxA16收获液均无交叉反应;检测EV71灭活疫苗原液纯化过程样品的抗原含量,能有效反映抗原纯化趋势;检测铝吸附疫苗成品解离后抗原含量,准确性较高。结论已建立了EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法线性好,特异性强,灵敏度高,准确性及重复性良好,可用于EV71疫苗生产过程中及终产品的抗原定量检测。
2010年01期 v.23 87-90页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K] [下载次数：908 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：25 ] |[阅读次数：0 ] - 薛力刚;刘金华;王全凯;王振国;
目的建立快速检测食品中金黄葡萄球菌的核酸探针检测法。方法通过使用吖啶酯标记的特异DNA探针检测金黄葡萄球菌,确定最高和最低探针浓度,验证该方法的特异性及敏感性,并与传统国标法的检测结果进行比较。结果核酸探针法最高探针浓度为2pmol∕50μl,最低探针浓度为0.25pmol∕50μl;该方法特异性良好,检出纯培养菌落最低限约为106cfu∕ml;与国标法检测结果一致性较高。结论核酸探针法可用于食品中金黄葡萄球菌的快速检测。
2010年01期 v.23 91-94页 [查看摘要][在线阅读][下载 162K] [下载次数：404 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ] - 辜正平;王伯初;旷瑜;
目的制备肝水解肽,并对其病毒灭活/去除工艺进行验证。方法以鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)为指示病毒,在100℃,pH6.0～7.0煮沸20min灭活病毒,用截留相对分子质量为10000的中空纤维柱,在进压0.15Mpa、回流压0.05Mpa和进压0.20Mpa、回流压0.10Mpa各循环超滤3次去除病毒,用无特定病原(SPF)的鸡胚和鸡成纤维细胞进行病毒灭活/去除的效果验证。结果加热煮沸后,指示病毒未检出,滴度降低NDV≥7.4logEID50/0.2ml、IBDV≥5.45logCCID50/0.1ml;超滤后IBDV未检出,滴度降低≥5.43logCCID50/0.1ml。盲传复壮均未检出病毒。制备的肝水解肽多肽含量均在20mg/ml以上。结论制备的肝水解肽工艺中两种灭活/去除病毒方法均有效,经灭活/去除病毒后的产品质量稳定。
2010年01期 v.23 95-97页 [查看摘要][在线阅读][下载 126K] [下载次数：228 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]