中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

疫苗研究

  • SARS-CoV-2收获液滴度稳定性及灭活动力学分析

    郭冰峰;韩斌;郝一楠;王魁;殷吉祥;李岩;李楠;凌相平;潘若文;

    目的 对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)收获液在2~8℃环境下的滴度稳定性及β-丙内酯灭活剂对病毒的灭活效果进行研究。方法 将3批(批号:202111001、202111002和202111003)SARS-CoV-2收获液于2~8℃放置12 d,每隔3 d(0、3、6、9、12 d)取样,采用Karber法检测病毒滴度;2~8℃过夜平衡的3批病毒收获液按1∶4 000的体积分数加入β-丙内酯进行灭活,在不同的灭活时间点(0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、16、24 h)取样检测病毒滴度,取灭活8.0、16、24 h的病毒液进行灭活验证,取灭活24 h的病毒灭活液进行透射电镜观察。结果 2~8℃环境下,SARS-CoV-2的滴度随放置时间的延长不断降低,0~3 d滴度下降不明显,第12天滴度由最初的7.75、6和7.5 lgCCID_(50)/mL降至5.75、4.625和6.25 lgCCID_(50)/mL,表明2~8℃环境下病毒活力呈逐渐降低的趋势;随着灭活时间的增加,病毒滴度不断降低,灭活3 h后,病毒滴度已无法检出。透射电镜观察显示,灭活后的病毒颗粒完整,刺突蛋白分布均匀。结论 2~8℃环境下保存的SARS-CoV-2毒力不稳定,应尽快进行后续的灭活纯化工艺;病毒灭活3 h后滴度已无法检出,可为灭活工艺的确定提供参考。

    2023年02期 v.36 129-132+144页 [查看摘要][在线阅读][下载 938K]
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基础研究

  • 短暂前脑缺血再灌注对大鼠海马中脑源性神经营养因子启动子与组蛋白去乙酰化酶3结合的影响及其作用机制

    张倩;严德萍;史晋朝;钟锦;周阳;赵欣;张宇;李建国;

    目的 评价短暂前脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)对大鼠海马中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)启动子与组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3,HDAC3)结合的影响,并探讨其作用机制。方法 采用Pulsinelli四血管夹闭法建立SD大鼠的I/R模型(I/R组),同时设假手术组(Sham组)。尼氏染色法观察大鼠海马中神经元存活情况;染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)法检测大鼠海马中BDNF启动子(Bdnf-p1、Bdnf-p2、Bdnf-p4和Bdnf-p6)与HDAC3的结合情况;qPCR法检测大鼠海马中反义脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor antisense,BDNF-AS)的表达情况。结果 与Sham组比较,I/R组大鼠海马CA1区神经元数目大幅减少,CA3和DG区神经元数目变化较小。I/R组大鼠海马CA1区中Bdnf-p1和Bdnf-p2与HDAC3结合水平明显降低(t分别为2.575和2.241,P均<0.05),Bdnf-p4和Bdnf-p6与HDAC3结合水平差异无统计学意义(t分别为1.033和0.348,P均>0.05);CA3区中Bdnf-p1和Bdnf-p2与HDAC3结合水平明显增加(t分别为12.600和3.191,P分别<0.001和<0.05),Bdnf-p6与HDAC3结合水平明显降低(t=4.029,P<0.05),Bdnf-p4与HDAC3结合水平差异无统计学意义(t=0.175,P>0.05);DG区中各BDNF启动子与HDAC3结合水平差异均无统计学意义(t=0.630~1.687,P均>0.05)。I/R组大鼠海马CA1区中BDNF-AS的表达水平明显降低(t=2.560,P<0.05),在CA3及DG区的表达水平均明显升高(t分别为3.543和3.637,P均<0.01)。结论 I/R对大鼠海马中BDNF启动子与HDAC3的结合水平有显著影响,可能是通过改变BDNF-AS表达水平发挥作用。

    2023年02期 v.36 133-137页 [查看摘要][在线阅读][下载 871K]
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  • 人鸟苷酸结合蛋白5基因启动子核心调控区域的鉴定及其转录活性分析

    叶婷;杨康;王田甜;廖玉娇;杜文倩;黄敏;蒋佩文;李敏惠;杨平;

    目的 构建人鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein 5,GBP5)基因启动子不同长度截短片段的荧光素酶报告基因质粒,通过分析启动子不同截短片段的转录活性,确定其核心调控区域。方法 PCR扩增GBP5基因启动子序列,将启动子序列截短为5个不同长度的片段,连接至载体pGL3-basic,构建重组质粒pGL3-GBP5-11/21/31/41/51。将各重组质粒转染至293FT细胞,检测荧光素酶活性;利用JASPAR软件预测GBP5启动子区域的转录因子结合位点,依据预测结果选取靶向核心调控区域的阴阳转录因子1(Yin-Yang transcription factor 1,YY1)进行转录调控活性验证;PCR扩增YY1的CDS序列,构建过表达质粒pIRES2-EGFP-YY1;将pIRES2-EGFP-YY1、pGL3-GBP5-21(-1 623~+47 bp)质粒与内参质粒pRL-CMV共转染至293FT细胞,检测荧光素酶活性,分析转录因子YY1对GBP5启动子活性的调控作用。结果 菌落PCR、双酶切鉴定证明人GBP5基因启动子报告基因质粒构建正确;JASPAR软件预测GBP5启动子区域存在STAT1、YY1、Foxp3等多个转录因子结合位点;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3-GBP5-21(-1 623~+47 bp)启动子活性最高,而pGL3-GBP5-41(-520~+47 bp)启动子活性明显降低,提示GBP5启动子核心区域位于5'UTR上游-1 623~-520 bp区域;过表达YY1能明显激活GBP5启动子活性,调控GBP5表达。结论人GBP5基因启动子的核心调控区域位于GBP5启动子5'UTR上游-1 623~-520 bp区域,该区域存在转录因子YY1结合位点,YY1过表达能显著影响GBP5启动子活性。

    2023年02期 v.36 138-144页 [查看摘要][在线阅读][下载 898K]
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  • 基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

    刘欣奕;安妮;章青;王宏;孔翔羽;王铭月;庞立丽;段招军;

    目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法 利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

    2023年02期 v.36 145-150+157页 [查看摘要][在线阅读][下载 968K]
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  • 内蒙古通辽地区犊牛腹泻大肠埃希菌毒力基因检测及耐药性分析

    杨斯琴;王平;查干哈斯;石顺利;

    目的 对内蒙古通辽地区犊牛腹泻大肠埃希菌(E. coli)的毒力基因进行检测,并分析其耐药性及耐药基因分布情况。方法 采用药敏纸片法检测从腹泻犊牛粪便样品分离鉴定的82株致病性E. coli对13种抗菌药物的敏感性,PCR法检测其13种毒力基因和12种耐药基因携带情况,并对其进行系统进化分群。结果 82株致病性E. coli中48.78%(40/82)、31.71%(26/82)、14.63%(12/82)和4.88%(4/82)分别属于A、B1、B2和D群,优势群系为A群(48.78%,40/82);共检测到11种毒力基因,未检测到tsh和LT1,其中irp2、fyuA、eaeA和STb的检出率较高,分别为79.27%(65/82)、63.41%(52/82)、53.66%(44/82)和50%(41/82),其他毒力基因检出率均低于50%。82株致病性E. coli对13种抗菌药物的耐药情况严重,其中对四环素、多西环素和阿莫西林的耐药性普遍较高,耐药菌株占比分别为100%(82/82)、97.56%(80/82)和90.24%(74/82);全部菌株表现出多重耐药,耐8种抗菌药物的菌株数最多(16/82,19.51%)。82株致病性E. coli中均检出12种耐药基因,其中β-内酰胺类(bla_(TEM))、磺胺类(sul1和sul2)、四环素类(tetB和tetD)和氨基糖苷类(aadB)耐药基因的检出率均高于70%。结论 82株致病性E. coli主要属于A系统群,毒力基因和耐药基因检出率较高,耐药性较高且具有多重耐药现象。本研究为内蒙古通辽地区犊牛大肠埃希菌病的防治及临床用药提供了参考。

    2023年02期 v.36 151-157页 [查看摘要][在线阅读][下载 848K]
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  • 人干扰素α1b体外抗SARS-CoV-2 Omicron株的药效

    刘琳琳;李玉薇;邹勇;张雪梅;卢佳;刘小可;王泽鋆;刘玉林;刘景会;

    目的 评价人干扰素(interferon,IFN)α1b体外抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)Omicron株的药效。方法 采用CCK-8法检测人IFNα1b原液、人IFNα1b滴眼液、人IFNα1b喷雾剂、瑞德西韦共4种药物的细胞毒性;qPCR法检测人IFNα1b对SARS-CoV-2 Omicron株(BA. 5/BA. 2/BA. 1)的抑制效果。结果 最高浓度(1×10~7IU/mL)人IFNα1b原液和最高浓度(150μmol/L)瑞德西韦对Vero细胞未达到半数细胞毒性;人IFNα1b滴眼液和人IFNα1b喷雾剂的半数毒性浓度(CC_(50))分别为29 958和37 550 IU/mL,对Vero细胞具有毒性。人IFNα1b提前孵育2 h后再攻毒,对BA. 1、BA. 2、BA. 5株的半数有效浓度(EC_(50))分别为9.30、13.38、12.33 IU/mL,瑞德西韦分别为0.314 7、0.291 0、0.300 3μmol/L。人IFNα1b与病毒同时孵育,对BA. 1、BA. 2、BA. 5株的EC_(50)分别为19.68、10.91、18.84 IU/mL,对照药瑞德西韦分别为0.320 5、0.274 4、0.304 1μmol/L。结论 在体外细胞水平上,极低活性的人IFNα1b即可对SARS-CoV-2 Omicron株具有较好的抑制作用,有望成为治疗SARS-CoV-2 Omicron株感染的临床特效药。

    2023年02期 v.36 158-162页 [查看摘要][在线阅读][下载 854K]
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  • 沉默E6相关蛋白对人乳头瘤病毒阴性宫颈癌细胞中p53蛋白表达水平的影响

    解亦航;郭宇微;孙渤轩;辛杨;于嘉敏;赵春艳;

    目的 探讨沉默E6相关蛋白(E6-associated protein,E6AP)对人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)阴性宫颈癌细胞(C33A)中p53蛋白表达水平的影响。方法 在LipofectamineTM2000转染试剂的介导下,将特异性沉默E6AP的siRNA序列(siE6AP)及沉默对照无序siRNA序列(siControl)分别转染C33A细胞。Western blot法检测siRNA对E6AP的沉默效果及细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。结果 siE6AP组C33A细胞中E6AP蛋白表达水平显著低于siControl组(t=-4.597,P<0.05)。siE6AP组C33A细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白表达水平均显著高于siControl组(t分别为4.533和7.099,P均<0.05)。结论 沉默E6AP可显著提高C33A细胞中p53蛋白的表达水平,表明沉默E6AP可能恢复C33A细胞中p53的活性和功能。

    2023年02期 v.36 163-165+171页 [查看摘要][在线阅读][下载 811K]
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  • 热量限制对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及其作用机制

    王文丽;贺忠梅;吉晔楠;孙思雨;杨瑞瑞;燕子;曹济民;

    目的 探讨热量限制(caloric restriction,CR)对小鼠心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)的影响及其作用机制。方法 将C57小鼠随机分为正常饮食组(AL组,自由摄食)和CR组(饮食量每2周递减10%),持续8周,监测体质量变化。每组再分为假手术组和MI/RI组,共4组,即AL+Sham组、AL+I/R组和CR+Sham组、CR+I/R组,其中MI/RI组小鼠结扎冠状动脉左前降支30 min后,再灌注24 h;Sham组只穿线不结扎。伊文思兰/TTC染色法检测小鼠心肌缺血和梗死面积;HE染色法对心肌组织进行病理学观察;相应试剂盒检测心肌组织中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、丙二醛(malondialdehvde,MDA)含量;ELISA法检测血清中IL-1β及IL-18含量;Western blot法检测心肌组织中细胞焦亡相关蛋白表达水平。结果 8周后,CR组小鼠体质量[(24.54±0.41)g]明显低于AL组[(31.46±0.25)g](t=14.34,P<0.05)。与AL+I/R组比较,CR+I/R组小鼠心肌缺血区面积差异无统计学意义(t=0.783 0,P>0.05),心梗面积明显减小(t=7.250,P<0.01);心肌排列相对整齐,病变程度明显减轻;LDH活性及CK-MB、MDA含量明显降低(t分别为4.331、2.875、5.343,P均<0.05),SOD活性明显增加(t=4.211,P<0.05);血清中IL-1β及IL-18含量均明显降低(t分别为3.375和4.266,P均<0.05);心肌组织中Nod样蛋白受体3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)、gasdermin蛋白家族D(gasdermin D,GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speckle-like protein,ASC)及caspase-1的表达水平均明显降低(t分别为3.412、3.420、3.480、2.585,P均<0.05)。结论 CR可减轻小鼠MI/RI,其作用机制与抑制心肌细胞焦亡有关。

    2023年02期 v.36 166-171页 [查看摘要][在线阅读][下载 892K]
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治疗制剂

  • 聚山梨酯对单克隆抗体药物稳定性的影响

    朱圣婴;曹嘉炜;徐进;陈晨辉;郭清城;李军;张大鹏;钱卫珠;侯盛;郭怀祖;

    目的 评估不同种类聚山梨酯(polysorbate,PS)对不同类型单克隆抗体(简称单抗)药物稳定性的影响。方法以单抗A(mAbA,IgG1前抗体药物)、单抗B(mAbB,IgG1单抗)和单抗C(mAbC,IgG1单抗,Fc N297A突变)3种单抗药物作为模型蛋白,分别在其各自的制剂处方中添加不同种类及含量的PS,并进行影响因素研究,通过考察蛋白聚集体、不溶性微粒等质量属性的变化,综合评估PS对单抗药物稳定性的影响。结果 PS20和PS80对于抑制3种单抗中聚集体及电荷异质体生成的作用差异均无统计学意义(P>0.05),而mAbB中加入PS80,mAbC中加入PS20分别能起到更显著地抑制不溶性微粒增加的效果(P<0.05);PS20含量的高低对于mAbC中电荷异质体及不溶性微粒的检测指标影响显著(P<0.05)。结论 不同类型的单抗对于不同种类、不同含量PS的敏感度不同,因此在进行单抗制剂处方设计时,需选择适合的PS种类及含量,以进一步提高单抗制剂的稳定性。

    2023年02期 v.36 172-177页 [查看摘要][在线阅读][下载 907K]
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临床研究

  • 暴露后接种人用纯化狂犬病疫苗(Vero细胞)安全性的Meta分析

    吴浩飞;王磊;葛灵睿;张静;杨文彬;徐奇;孟胜利;

    目的 对暴露后接种人用纯化狂犬病疫苗(Vero细胞)(purified Vero cell rabies vaccine,PVRV)的安全性进行Meta分析。方法 以狂犬病、疫苗和安全性为关键词,分别于PubMed、EMBASE、Cochrane和中国知网(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)检索文献,并辅以人工检索。根据纳入和排除标准筛选文献并提取数据,应用Review Manager 5.4软件对两种免疫方案(Zagreb和Essen)的不良反应事件发生率进行Meta分析。结果 共纳入12项研究,其中7项为前瞻性研究,5项为回顾性研究。大多数纳入研究的偏倚风险较低。Zagreb方案不良反应事件的发生率显著高于Essen方案[相对危险度(relative risk,RR):1.01,95%CI:0.90~1.14;I~2=73.00%,P<0.05],但存在高度异质性差异。Zagreb方案发热、疼痛和硬结事件的发生率显著高于Essen方案(RR分别为1.14、0.92、0.86,95%CI分别为0.82~1.60、0.73~1.14、0.29~2.51;I~2分别为81%、65%、92%,P<0.01)。结论 暴露后采用两种方案接种PVRV均具有良好的安全性,但采用Zagreb方案免疫时,应注意儿童和老年人等免疫能力相对较差人群的身体状况,以免发生不良反应事件。

    2023年02期 v.36 178-182页 [查看摘要][在线阅读][下载 1042K]
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  • 2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒流行株基因序列的特征分析

    夏立新;孙跃秋;王梦涵;姜雪鸥;周莹;顾建阳;

    目的 对2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)流行株进行基因型鉴定及分子特征分析。方法 选择59例2021—2022年吉林大学中日联谊医院收治的长春市水痘或带状疱疹患者为研究对象,采用膜抗原荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)法对患者血清中VZV特异性抗体进行鉴定。提取确诊患者疱疹液中的病毒DNA,PCR扩增VZV的多个开放阅读框(open reading frame,ORF),包括ORF1、ORF12、ORF16、ORF17、ORF21、ORF22、ORF37和ORF54,根据ORF的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行基因分型。通过限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术对多个ORF(ORF38、ORF54和ORF62)进行酶切鉴定,区分VZV临床株及疫苗株。结果 59份患者血清样本均为阳性,均确诊为VZV感染。59份疱疹液样本中,4份与Clade 2基因型完全匹配;4份存在2个SNPs,分别为ORF1(SNP790)C→A突变和ORF12(SNP18 082)T→C突变;51份发生ORF12(SNP18 082)T→C突变。59株VZV临床株均为PstⅠ+BglⅠ+SmaⅠ-,不同于疫苗株PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ+。结论 2021—2022年长春市VZV流行株均为Clade2基因型,未发现疫苗株致病情况。

    2023年02期 v.36 183-186+192页 [查看摘要][在线阅读][下载 811K]
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技术方法

  • TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法的建立及验证

    毕华;卢宁;牛林茹;王玉哲;朱香;李文慧;杨凌;赵君;周勇;梁雅丽;

    目的 建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法 采用正交试验确定捕获抗体、检测抗体最佳浓度,建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法,并对方法进行线性范围、特异性、检测限、定量限、准确性、重复性验证;采用建立的方法检测多种生物制品,验证方法的适用性。结果 选定捕获抗体用3μg/mL浓度包板,检测抗体稀释15 000倍建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法。该方法线性范围为0.41~40.00 ng/mL,检测限为0.258 ng/mL,定量限为0.5 ng/mL;检测标准品、样品时,测量偏差小于5%;重复性验证CV<5%;不同类型样品加标回收率在80%~120%之间。结论 建立的TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法特异性、准确性、重复性良好,可准确、有效、快捷地检测各种类型生物制品中TrypLE的残留量。

    2023年02期 v.36 187-192页 [查看摘要][在线阅读][下载 815K]
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  • 新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆中多重病原体检测方法的验证

    王月;张金;喻剑虹;刘莹;罗艳;张林林;郭佳茹;向阳;张雪;赵传波;彭干;陈鄂湘;何彦林;李策生;杨晓明;

    目的 对新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)康复者恢复期血浆中多重病原体检测方法进行系统性验证。方法 根据血浆样本实际情况,并结合试剂盒要求,分别对COVID-19康复者恢复期血浆中多重病原体分子生物学检测方法进行专属性、重复性、中间精密度及检测限验证,并对50份COVID-19康复者恢复期血浆样本进行方法适用性确认。结果 干扰试验和交叉试验结果均显示阳性样本和阴性样本检测均未受影响;同一检测人员或不同检测人员在不同时间相同检测条件下重复检测阳性对照4种病原体熔解温度(melting temperature,Tm)值的RSD分别为0.07%、0.14%、0.07%、0.14%和0.06%、0.23%、0.23%、0.20%,阴性对照内部质控(internal control,IC)和扩增质控(amplification quality control,AC)1和2 Tm值的RSD分别为0.07%、0.01%、0.07%、0.14%和0.11%、0.10%、0.15%、0.22%,重复性和中间精密度RSD均分别小于15%和20%,符合要求;确定了22种病原体的最低检测限;50份COVID-19康复者恢复期血浆样本均未检出病原体。结论 COVID-19康复者恢复期血浆中病原体检测方法专属性强、稳定可靠、重复性好,适用于COVID-19康复者恢复期血浆中病原体检测。

    2023年02期 v.36 193-199+206页 [查看摘要][在线阅读][下载 898K]
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  • CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

    张凯宁;刘涵;朱秋媚;富锐丽;刘玉林;孙瑞欣;刘景会;赵竞男;韩雪容;

    目的 优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法 在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基:Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果 Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少。结论 Gly-1培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,Gly-2培养基使糖基化修饰从G2F、G1F向G0F转变,Gly-3培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,且高甘露糖含量在5%以下。Gly-3培养基可能具有更好的修改目的蛋白糖基化类型及比例的效果。

    2023年02期 v.36 200-206页 [查看摘要][在线阅读][下载 1016K]
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  • 森林脑炎病毒滴度检测蚀斑法的建立及验证

    陈娜娜;陈诗阳;王颖;杜翔宇;苗会;拱小棠;刘双军;李景良;

    目的 建立原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞适应的森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)株(简称PHKT株)感染性滴度检测的蚀斑法,并对建立的方法进行验证。方法 将主代鼠脑适应株TBEV感染原代地鼠肾PHK细胞,连续传12代。分别采用蚀斑法(将不同代次PHKT以不同稀释倍数感染单层BHK-21细胞,中性红染色,计算蚀斑数)和小鼠脑内攻毒滴定法(将不同代次PHKT以不同稀倍数经脑腔攻击小鼠,0.03 mL/只,连续观察14 d,Reed-Muench方法计算半数致死量)检测PHKT滴度,并对两种方法检测结果的相关性进行分析。对建立的检测TBEV滴度的蚀斑法进行专属性、重复性和中间精密度验证。结果 PHKT病毒蚀斑滴度最高达8.9 lgPFU/mL;蚀斑法与小鼠脑内攻毒滴定法检测结果相关性较好(r=0.92);蚀斑法检测PHKT病毒感染性滴度专属性良好,重复性和中间精密度变异系数(CV)均<5%。结论 建立了检测PHKT感染性滴度的蚀斑法,可作为小鼠脑内攻毒滴定法的替代方法。

    2023年02期 v.36 207-210+216页 [查看摘要][在线阅读][下载 822K]
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  • 肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中4-二甲氨基吡啶残留量高效液相色谱检测方法的建立及验证

    李双花;赵萍;田洪敏;李红;董威;陈煜;鲍路伟;吴克;

    目的 建立肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)含量检测的高效液相色谱(HPLC)法,并对该方法进行验证。方法 通过对色谱柱类型、流动相组成的优化建立检测肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗中DMAP残留量的HPLC法,对该方法进行专属性、准确度、重复性和重现性验证,并确定检出限、定量限及线性范围。用建立的方法检测13种不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗及1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化肺炎球菌多糖中间产物中DMAP残留量。结果 优化后的色谱条件:色谱柱为Sepax HP-C18(5μm,4.6 mm×250 mm);流动相为5 mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含20 mmol/L磷酸二氢钾,磷酸调pH至3.0)∶乙腈=87∶13(V/V);检测波长为280 nm;流速为1 mL/min;进样体积为10μL;柱温为35℃。该方法不受供试品机制和前处理溶剂的干扰,专属性好;检出限和定量限分别为3.6和14.4 ng/mL,在0.05~10μg/mL范围内线性良好,R2=0.999 9;加标回收率为83%~105%,重复性RSD为0.28%~0.72%,重现性RSD为7.38%。13种不同血清型肺炎球菌多糖-CRM197蛋白结合疫苗中DMAP残留量为0.135~1.635μg/mL;CDAP活化肺炎球菌多糖第一步中间产物即可检测出DMAP,未检测到CDAP。结论 建立的HPLC法操作简便,专属性、准确度、重复性和重现性均较好,可作为肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗质量控制的有效检测方法。

    2023年02期 v.36 211-216页 [查看摘要][在线阅读][下载 839K]
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综述

  • 人免疫缺陷病毒广谱中和抗体的研究进展

    张慧;邓婷婷;李少伟;顾颖;

    艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球性公共卫生问题,对人类生命健康造成了重大影响。人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)是AIDS的主要致病原,具有高变异性和潜伏性,因此缺乏有效的疫苗和药物进行AIDS的预防及治疗。HIV-1广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)在机体内可针对HIV-1感染产生有效的免疫应答,可同时中和不同型别毒株,在预防HIV-1感染及控制AIDS进程中具有巨大应用潜力。本文就HIV-1 bNAbs的产生及获得、分类及特点、应用情况作一综述,以期为后续HIV-1疫苗研究和抗体药物开发提供参考。

    2023年02期 v.36 217-223+234页 [查看摘要][在线阅读][下载 836K]
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  • 蛋白质组学在结肠癌研究中的进展

    吴傲;张丽军;

    结肠癌的诊断及治疗一直是医疗界的难题。近年有关结肠癌差异蛋白质的研究越来越多,运用蛋白质组学技术发现癌症组织中的差异蛋白质,并研究其在癌症中的功能及作用,从而用于癌症的诊断和治疗,已成为一种新的趋势。本课题组前期通过蛋白质组学技术发现乳腺癌相关耐药蛋白2(ATP-binding cassette sub-family G member 2,ABCG2)和蛋白质二硫异构酶A2(protein disulfide-isomerase A2,PDIA2)两种结肠癌差异蛋白质,本文对这两种蛋白质在结肠癌中的表达及功能作一综述。

    2023年02期 v.36 224-229页 [查看摘要][在线阅读][下载 870K]
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  • SARS-CoV-2抗体标准物质的研制及应用进展

    张辉;毛群颖;梁争论;徐苗;

    严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)严重威胁人类健康和公共卫生安全。接种疫苗对有效控制疫情具有重要作用,全球已有150多个SARS-CoV-2疫苗进入临床试验阶段,38个批准紧急使用或上市。中和抗体水平是评价疫苗免疫原性的主要指标,但至今尚无标准化的SARS-CoV-2中和抗体检测方法,不同实验室和不同产品之间的中和抗体水平难以进行横向比较,严重制约疫苗和抗体类治疗药物的研发和评价。随着第一代SARS-CoV-2抗体标准品的快速售罄及SARS-CoV-2值得关注变异株(variants of concern,VOC)不断出现,2022年,WHO与我国同步开展了第二代标准品的研制工作。本文就WHO和我国SARS-CoV-2抗体标准物质的研制及应用进展作一综述。

    2023年02期 v.36 230-234页 [查看摘要][在线阅读][下载 796K]
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  • 无细胞百日咳疫苗研发与接种现状及前景

    崔乐乐;谌志筠;何秋水;

    百日咳是传染性极强的呼吸系统疾病,主要影响婴幼儿。接种疫苗是预防百日咳感染的有效措施。无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines,aPVs)因副作用更小,在许多国家已取代全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines,wPVs)。尽管疫苗接种覆盖率较高,但aPVs的免疫力维持时间较短,被认为是百日咳重现的重要原因。针对百日咳疫苗的改进,基因脱毒疫苗及减毒活疫苗已取得了明显的临床效果,其他改进策略包括在现有aPVs中使用新型佐剂、增加抗原,或采用纳米颗粒包装等也具有良好的发展前景。本文就目前aPVs的抗原组分和保护效果,不同国家的接种程序,及潜在的百日咳疫苗候选组分和预防百日咳的新策略作一综述。

    2023年02期 v.36 235-239+244页 [查看摘要][在线阅读][下载 783K]
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  • 微小RNA在恶性肿瘤中对蛋白酪氨酸激酶6调控作用的研究进展

    高娜;楚惠媛;陈彻;

    蛋白酪氨酸激酶6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)是一种非受体酪氨酸激酶,在各类肿瘤的发生发展中起关键作用,且在肿瘤中的作用具有双重性。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种调节转录后基因表达的小非编码RNA。近年来,越来越多的研究表明,miRNA对PTK6的调控作用在肿瘤中起重要作用。本文对在不同癌症中miRNA对PTK6表达的影响作一综述,以期为癌症治疗提供理论依据。

    2023年02期 v.36 240-244页 [查看摘要][在线阅读][下载 797K]
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  • 鲍曼不动杆菌致病机制及相应疫苗的研究现状

    马源;宋磊;罗招庆;

    鲍曼不动杆菌是一种革兰阴性菌,是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,主要感染肺等多种人体器官,最终引起菌血症、肺炎等疾病,严重威胁患者生命,免疫力较弱的人群是重要易感人群。该菌抗逆性强,对抗生素有多重耐药性,其造成的感染是临床治疗的难题。鲍曼不动杆菌的外膜复合物(outer membrane complex,OMC)、外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)、分泌系统和脂多糖等在该菌感染宿主细胞过程中发挥重要作用。目前,针对这些致病组分开发的疫苗对鲍曼不动杆菌感染可起到一定的预防和治疗作用,具有良好的应用前景。本文就鲍曼不动杆菌的致病机制及疫苗研发的现状作一综述,以期为临床鲍曼不动杆菌新型防治手段的研发提供参考。

    2023年02期 v.36 245-251+256页 [查看摘要][在线阅读][下载 816K]
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专题报道

  • 生物制品国家标准物质生命周期管理的思考

    王一平;谭德讲;孙会敏;毛群颖;梁争论;

    <正>标准物质具有复现、保存和传递量值的作用,对实现测量结果的溯源性,保证测量结果在时间与空间上的连续性与可比性,进而确保测量结果的可靠、有效与国际互认具有关键作用。生物制品国家标准物质指用于生物制品效价、活性或含量测定或其特性鉴别、检查的生物标准品、生物参考品~([1])。与化学标准物质不同,生物制品国家标准物质基于其结构复杂性和应用特性,具有稳定性要求高、

    2023年02期 v.36 252-256页 [查看摘要][在线阅读][下载 794K]
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