中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

疫苗研究

  • 基于柯萨奇病毒-A5复制子的SARS-CoV-2自扩增RNA疫苗的构建及其免疫原性评价

    付烈;靳卫平;杨洁;吴杰;卢佳;郭靖;孟胜利;王泽鋆;于代冠;申硕;

    目的 构建基于柯萨奇病毒-A5(Coxsackievirus-A5,CV-A5)复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株(B. 1.617.2)自扩增RNA(self-amplifying RNA,saRNA)疫苗,并评价其免疫原性。方法 以含有CV-A5全长基因组序列的质粒为基础,通过In-fusion克隆将SARS-CoV-2Delta突变株S蛋白基因替换不同长度的CV-A5 P1结构蛋白基因,分别构建重组质粒pDelta-S10、pDelta-S5和pDeltaS1(融合多聚蛋白的S-VP1/2A酶切位点上游的氨基酸分别为10、5和1个)。通过线性化重组质粒体外转录获得3种RNA分子Delta-S10、Delta-S5和Delta-S1。将3种RNA分子分别转染HEK-293T细胞,Western blot分析S蛋白的表达,筛选出S蛋白表达量最高的RNA分子,qPCR检测其在HEK-293T细胞中的自扩增。将筛选出的Delta-S用脂质纳米颗粒包装后,通过肌肉注射方式,采用两种剂量(0.5和2.5μg)免疫BALB/c小鼠(雌性,6~8周龄,每组5只),于第1和14天各免疫1次,第14和28天采血,ELISA法检测血清结合抗体滴度,微量中和法检测中和抗体滴度;第42天摘取脾脏,酶联免疫斑点技术(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)检测小鼠脾细胞分泌IFNγ水平。结果构建的重组RNA分子S蛋白表达量最高的为Delta-S10,其可在HEK-293T细胞中进行自扩增。Delta-S10高低剂量组均可诱导小鼠产生抗SARS-CoV-2 Delta S1蛋白特异性结合抗体,且剂量效应和加强免疫效应明显;Delta-S10高剂量组可诱导小鼠产生中和抗体,且可在小鼠体内诱导细胞免疫应答。结论 成功构建了基于CV-A5复制子的SARSCoV-2 Delta突变株(B. 1.617.2)saRNA疫苗Delta-S10,其可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,为肠道病毒复制元件构建新冠saRNA疫苗的深入研究奠定了基础。

    2023年03期 v.36 257-262+268页 [查看摘要][在线阅读][下载 901K]
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  • 腮腺炎减毒活疫苗(F-基因型)免疫血清中和抗体效价与特异性IgG浓度的比较分析

    赵恒;廖芸;将国润;李丹丹;张莹;范胜涛;于丽;李琦涵;

    目的 对腮腺炎减毒活疫苗(F-基因型)免疫血清中和抗体效价及特异性IgG浓度进行比较分析,评价二者作为相互验证指标的可能性。方法 选取194份人免疫血清,包括疫苗组98份[腮腺炎减毒活疫苗(F-基因型),免疫前后各49份]和安慰剂组96份(不含腮腺炎病毒,其他成分与疫苗组相同,免疫前后各48份),采用ELISA法和中和试验分别检测血清腮腺炎病毒特异性IgG浓度和中和抗体效价,并对两个指标的检测结果进行比较。以中和抗体效价为纵坐标,IgG浓度为横坐标绘制散点图,通过逻辑回归分析二者的相关性。以中和抗体效价为标准采用ROC曲线对各组特异性IgG浓度进行分析,评价以特异性IgG浓度判定中和抗体阳转的可靠性。结果 安慰剂组免疫前血清特异性IgG浓度(t=-0.977,P> 0.05)及中和抗体效价与免疫后比较,差异均无统计学意义(Z=-1.405,P> 0.05),疫苗组免疫后血清特异性IgG浓度(t=-9.959,P <0.001)及中和抗体效价(Z=-5.696,P <0.001)均明显高于免疫前。安慰剂组免疫前后及疫苗组免疫前IgG阳转率均明显高于相应中和抗体阳转率(χ~2分别为27.927、29.777、17.563,P均<0.001),疫苗组免疫后IgG阳转率与中和抗体阳转率差异无统计学意义(χ~2=2.346,P> 0.05)。各组特异性IgG浓度与中和抗体效价间具有显著相关性(r=0.321 0~0.620 1,P均<0.05)。疫苗组免疫后的ROC曲线下面积最大(0.961),特异性(1.00)和灵敏度(0.93)较高。结论 腮腺炎减毒活疫苗(F-基因型)免疫血清中和抗体效价与特异性IgG浓度具有良好的相关性,二者可作为相互验证的指标。

    2023年03期 v.36 263-268页 [查看摘要][在线阅读][下载 919K]
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基础研究

  • 九香虫CcPT1蛋白的原核表达及纯化

    张书琪;檀军;蔡仁莲;郭建军;罗睿;

    目的 原核表达九香虫Cc PT1蛋白,并进行纯化。方法 将合成的Cc PT1基因克隆至载体p GEX-4T-1,构建重组表达质粒p GEX-4T1-Cc PT1,转化感受态E. coli Rosetta,经IPTG诱导表达重组蛋白,并优化诱导表达的温度(20及37℃)、IPTG终浓度(0.25、0.5、0.75、1 mmol/L)及时间(6、8、10、12 h)。采用GST蛋白纯化系统纯化重组蛋白,纯化产物经10%SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,纯化过程中采用Pre Scission Protease去除GST标签。结果 重组蛋白GST-Cc PT1相对分子质量约为29 800,大小与预期相符,主要以包涵体形式表达,蛋白浓度为0.026 9 mg/m L。最适诱导条件为:20℃下,采用终浓度0.75 mol/L的IPTG诱导12 h。纯化蛋白纯度> 90%,且可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性结合。去除GST标签后的Cc PT1蛋白相对分子质量约为2 830,蛋白得率达11.15%。结论 经原核表达获得了纯度较高的九香虫Cc PT1蛋白,为九香虫抗癌肽的深入研究奠定了基础。

    2023年03期 v.36 269-273页 [查看摘要][在线阅读][下载 860K]
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  • Loop结构A79Y和T81Q定点突变对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

    凌少华;李思琪;蒋月;叶明洋;吕婷婷;王冶;李恩中;李同彪;

    目的 识别溶糖曲霉(Aspergillus saccharolyticus)JOP 1030-1木聚糖酶Xyn ASP Loop结构中的热稳定性位点,提高其热稳定性。方法 利用Fireprot在线服务器预测木聚糖酶热稳定性相关氨基酸位点,在Loop结构中筛选有益突变位点。通过定点突变构建单点突变体Xyn~(A79Y)、Xyn~(T81Q)及双点突变体Xyn~(LQ)(A79Y/T81Q)。将重组突变质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒对重组木聚糖酶进行纯化,并测定酶的最适温度及热稳定性、最适pH及pH稳定性。结果 在Loop结构中筛选出有益突变位点A79Y和T81Q,纯化后的蛋白样品纯度较高。相比野生型Xyn ASP,突变体Xyn~(A79Y)、Xyn~(T81Q)及Xyn~(LQ)的最适温度分别提高了10、5和5℃。40℃热处理30 min,野生型Xyn ASP仅保留30.2%残余酶活力,而突变体Xyn~(T81Q)为37.7%,Xyn~(A79Y)和Xyn~(LQ)仍高达65%以上。60℃热处理30 min,野生型Xyn ASP酶活力为7.1%,而Xyn~(LQ)仍保留26.4%的酶活力。相比野生型Xyn ASP,突变体热稳定性均有所提高。Xyn~(A79Y)、Xyn~(T81Q)和Xyn~(LQ)最适p H为5.0,较野生型Xyn ASP(p H 6.0)有所降低,在pH 3.0~8.0下的pH稳定性,Xyn~(A79Y)、Xyn~(T81Q)及Xyn~(LQ)与野生型相比无明显变化。结论 在Loop结构中进行定点突变(A79Y和T81Q),获得了热稳定性明显提高的木聚糖酶突变体,为后期该酶的结构功能与关系研究以及工业化应用奠定了基础。

    2023年03期 v.36 274-280页 [查看摘要][在线阅读][下载 1048K]
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  • Sox11基因对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

    吕烨;明文华;栾志琳;

    目的 探讨Sox11基因对小鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)的保护作用及其机制,为CIRI的治疗提供新的靶点。方法 建立小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和Neuro2A细胞氧糖剥离再灌注(oxygen glucose deprivation reperfusion,OGDR)模型,采用实时定量PCR、Western blot、免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色技术检测Sox11在MCAO和OGDR模型中的时间和空间分布;Western blot法检测Sox11基因表达干扰后,OGDR模型中细胞凋亡和炎症反应等通路重要基因的表达改变。结果 Sox11 mRNA和蛋白表达水平在小鼠MCAO模型和Neuro2A OGDR模型中均显著上升(P=0.000 1~0.038 8);小鼠CIRI后,Sox11表达升高集中于海马体的海马齿状回(dentate gyrus,DG)区域;在OGDR模型中干扰Sox11表达后,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3表达量显著升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低,同时炎症反应相关的磷酸化NF-κB(pNF-κB)蛋白表达量也显著上调。结论 Sox11基因对小鼠CIRI具有保护作用,并参与CIRI后细胞凋亡和炎症反应等通路的调控。

    2023年03期 v.36 281-287页 [查看摘要][在线阅读][下载 1167K]
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治疗制剂

  • 新型锰佐剂联合肿瘤抗原抗肿瘤效果评价

    杨立群;梁朝远;韩卢;石思伟;盛望;

    目的 探讨新型环状鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)/干扰素基因刺激(stimulator of interferon genes,STING)通路激动剂MnCl_2联合肿瘤细胞裂解物(Lysate)和小鼠结肠癌MC38细胞系新抗原10K-Adpgk的抗肿瘤效果。方法 从小鼠骨髓提取骨髓来源树突细胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC),分为3组:PBS、1μmol/L MnCl_2和10μmol/L MnCl_2组,流式细胞术分析BMDC成熟情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6浓度,q PCR法检测BMDC中相关IL-6、IFN-α、IFNβ、CXCL9基因转录水平。采用MC38细胞系建立小鼠肿瘤模型,当肿瘤体积达100 mm3时,随机分为PBS、Lysate、MnCl_2、10K-Adpgk、Lysate+MnCl_2组以及Lysate+10K-Adpgk+MnCl_2联合治疗组,均经尾部皮下给药,共给药3次,每次间隔1周,期间每2 d测量肿瘤体积,最后1次给药后1周,眼眶取血,分离血清,ELISA法检测IFNγ和TNF-α浓度;分离小鼠肿瘤及脾脏,流式细胞术检测外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T细胞、肿瘤浸润性T细胞及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例,ELISPOT试验检测脾脏中抗原特异性T细胞比例。结果 10μmol/L MnCl_2可刺激BMDC成熟,激活后续免疫过程。联合治疗组小鼠肿瘤体积远小于PBS组,血清中IFNγ和TNF-α含量高于其他组,肿瘤浸润性T细胞、PBMC中T细胞以及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例与PBS组相比,也明显升高。联合治疗可引起强烈的抗原特异性T细胞免疫反应。结论 新型佐剂MnCl_2的加入显著增强了肿瘤细胞裂解物和新抗原的治疗效果,为开发基于MnCl_2以及肿瘤抗原联合治疗肿瘤的方法提供了实验依据。

    2023年03期 v.36 288-294+305页 [查看摘要][在线阅读][下载 993K]
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诊断制剂

  • 抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域单链抗体的筛选及鉴定

    金佳佩;蔡雪飞;

    目的 构建抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突糖蛋白(spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)噬菌体展示文库,筛选特异性scFv,并进行功能鉴定。方法 提取RBD蛋白免疫小鼠的脾细胞m RNA,逆转录为c DNA,以其为模板扩增scFv的重链可变区(hight chain fragment of variable,VH)和轻链可变区(light chain fragment of variable,VL)基因,经过重叠延伸PCR扩增(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)组装为scFv基因片段。将scFv基因片段插入噬菌体载体,构建scFv噬菌体展示文库。经4轮生物淘洗,筛选出与RBD结合能力较强的scFv基因,进行重组表达、纯化和生物活性鉴定。结果 构建的scFv噬菌体文库滴度为6.0×10~(11)pfu/m L。经4轮生物淘选后,共筛选出4株与RBD结合较强的scFv,分别为scFv11、scFv12、scFv25、scFv28。scFv相对分子质量约为27 000,多以包涵体形式存在,纯化后可与HRP标记的鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合,浓度达2.4 mg/m L,纯度约90%。4株scFv均可与RBD重组蛋白发生特异性结合;除scFv28外,其他3株scFv均可与野生型和多突变株S蛋白结合;与RBD均存在剂量依赖性相互作用,亲和力动态拟合解离常数(K_D)分别为8.9、5.92、10.67、2.36 nmol/L,稳态拟合解离常数(K_D)分别为5.3、6.5、8.7、5.8 nmol/L;scFv11、scFv12和scFv25可同时识别3个独立的RBD多肽,包括RBD2(S~(334~353))、RBD9(S~(439~458))和RBD13(S~(499~518));在线服务器SWISS-MODEL对scFv进行同源建模的模型质量良好,可用于分子对接;scFv11及人肺泡上皮细胞表面血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,ACE2)与RBD相互作用的界面仅部分重合,scFv12和scFv25与RBD的相互作用界面和ACE2与RBD相互作用界面存在较大差异。结论 本研究通过构建抗SARS-Co V-2 RBD的scFv噬菌体文库,筛选并制备了可与SARS-Co V-2 RBD特异结合的scFv,为进一步抗SARS-Co V-2药物和检测试剂的研发提供了实验依据。

    2023年03期 v.36 295-305页 [查看摘要][在线阅读][下载 1227K]
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  • 嗜肺军团菌胶体金检测试纸性能评估

    任萌;张世凯;杨波;王毅;胡征;

    目的 制备嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)快速检测的胶体金免疫层析试纸,并对其进行性能测试,确保其符合国家临床诊断标准。方法 基于双抗体夹心ELISA法制备LP胶体金免疫层析试纸,并对其交叉反应性、抗干扰性、灵敏度、钩状效应、稳定性等进行测试。结果 LP胶体金免疫层析试纸与呼吸道常见的卡他莫拉菌等22种病原菌均无交叉反应,不受呼吸道内外源干扰物的影响;对LP的最低检测限可达2.00×10~5cfu/m L,具有良好的灵敏度,无钩状效应;在45℃加速老化以及模拟高温运输、冷冻运输条件下,重复性和稳定性均不受影响,且同一批次内、不同批次间试纸稳定性均良好。结论 制备的LP胶体金免疫层析试纸可实现LP的快速检测,操作简便,具有较好的应用前景和推广价值。

    2023年03期 v.36 306-309+314页 [查看摘要][在线阅读][下载 858K]
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  • 重组幽门螺旋杆菌黏附素A的可溶性表达、纯化及其免疫学性质分析

    刘昆梅;张富蕊;李欣;张国林;刘宏鹏;郭乐;

    目的 通过分子克隆、蛋白表达及纯化等技术获得重组幽门螺旋杆菌黏附素A(recombinant H. pylori adhesin A,rHpaA),免疫BALB/c小鼠,制备anti-HpaA多克隆抗体后,分析其抗体特异性。方法 利用Phyre2和DNAstar生物信息学软件分析rHpaA的三维结构及抗原性质;通过PCR长片段DNA合成技术获得黏附素HpaA基因,插入质粒pCzn1中,制备重组质粒pCzn1-rHpaA,转化E. coli Arctic Express(DE3),经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析纯化后,获得rHpaA蛋白,Western blot鉴定其反应原性。将rHpaA辅以弗氏佐剂免疫雄性BALB/c小鼠,共6只,制备antiHpaA多克隆抗体,ELISA法鉴定其抗体特异性。结果 rHpaA具有较好的三维结构及抗原性质。双酶切鉴定及基因测序证明,重组质粒pCzn1-rHpaA含有完全正确的HpaA基因序列。重组菌株pCzn1-rHpaA/Arctic Express可溶性表达目的蛋白rHpaA,约占上清总蛋白的68.3%,纯度达98.1%。rHpaA可与anti-His和anti-H. pylori抗体相结合;antiHpaA多克隆抗体可特异性识别rHpaA和H. pylori裂解物。结论 经低温诱导表达和蛋白纯化等技术,可获得高纯度目的蛋白rHpaA,制备的anti-HpaA多克隆抗体具有良好的特异性,为研究H. pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

    2023年03期 v.36 310-314页 [查看摘要][在线阅读][下载 1078K]
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临床研究

  • 上海市金山区肠道病毒71型灭活疫苗接种情况及接种前后手足口病流行病学和病原学变化分析

    姚红岑;周杰;董兆鹏;孙箐爽;吴洪彦;杜荐如;汤喜红;李淑华;

    目的 了解上海市金山区肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗接种水平及其对该区手足口病(handfood-mouth disease,HFMD)流行病学和病原谱变化的影响,为改进该区HFMD防控策略提供依据。方法 收集上海市金山区免疫规划信息综合管理系统中2016—2019年EV71灭活疫苗接种资料,描述接种特征;提取“中国疾病监测报告信息系统”中2013—2019年金山区HFMD病例资料,获取同期该区HFMD病原监测信息,比较接种前后HFMD发病率、病原阳性检出率等的差异性。结果 2016年11月—2019年12月,金山区共接种EV71灭活疫苗63 521剂次,第1针接种率为22.57%,全程接种率为21.05%,两剂次基础免疫完成率为94.65%。不同年份、月份、现住址、年龄、户籍等接种率存在差异性(P均<0.05),第1针接种率2018年最高(33.45%),全程接种率2017年最高(30.78%),5—8月份接种量较大,6~11月龄接种率最高,1岁以上接种量最大,本市儿童接种率高于流动儿童。接种前后HFMD发病率差异无统计学意义(χ2=0.427,P=0.513),接种后重症发病率、EV71阳性检出率、EV71感染HFMD估算发病率均显著降低(χ2分别为15.312、41.431和432.342,P均<0.001)。结论 接种EV71灭活疫苗降低了金山区HFMD EV71感染和重症发生,但接种率水平较低,还需关注HFMD病原谱变化,预防其他肠道病毒感染。建议加强宣传和信息化手段提高接种率,加快联合疫苗研发,提供更多抗体保护。

    2023年03期 v.36 315-320+329页 [查看摘要][在线阅读][下载 889K]
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技术方法

  • 碱性木聚糖酶高产菌株的筛选鉴定、酶学性质检测及培养条件优化

    高玲;吴陈彬;吴思佳;黄世豪;朱泓兴;尹良鸿;钱永常;

    目的 筛选碱性木聚糖酶的高产菌株,并对其进行分子鉴定、酶学性质检测及培养条件优化。方法 采集山西、河南和浙江农田土壤样品,通过富集培养及分离后进行16S rDNA鉴定,筛选碱性木聚糖酶的高产菌株,并检测其酶学性质。单因素试验优化发酵条件,包括培养基碳源(木聚糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、麸皮、葡萄糖)、氮源[草酸铵、蛋白胨、酵母粉、(NH_4)_2SO_4、NH_4Cl、NaNO_3、尿素、牛肉膏、大豆粉、KNO_3、(NH_4)_2HPO_4或以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、(NH_4)_2HPO_4、大豆粉两两随机组合]、金属离子[CuCl_2、MgCl_2、ZnCl_2、Al_2(SO_4)_3、CoCl_2、MnCl_2、Ag NO_3、NaCl、CaCl_2、FeCl_2、BaCl_2、FeCl_3]、pH(3.0~10.0)及发酵温度(25、28、30、33、35、37、40℃),响应面法优化培养基组分含量[木聚糖、(NH_4)_2HPO_4和大豆粉]。采用优化的培养条件培养碱性木聚糖高产菌株,检测木聚糖酶酶活,并与模型预测结果进行对比。结果筛选出1株碱性木聚糖酶高产菌株,命名为SX6-18,经16S rDNA鉴定为类芽孢杆菌(Paemibacillus)。SX6-18菌株产生的碱性木聚糖酶在温度为25~55℃和pH 6.0~10.0的范围内可保持70%以上的相对活性;Mg~(2+)可促进碱性木聚糖酶活,Fe~(3+)、Mn~(2+)和Cu~(2+)抑制酶活。确定最适碳源为木聚糖,氮源为大豆粉和(NH_4)_2HPO_4组合,金属离子为Fe~(3+),pH为8.0,发酵温度为30℃。确定最适培养基组分含量为:15.00 g/L木聚糖、3.03 g/L(NH_4)_2HPO_4、3.28 g/L大豆粉。采用优化的培养基及发酵条件下生产的碱性木聚糖酶酶活达701.08 U/mL,与预测值(693.96 U/mL)相近。结论 成功筛选出了1株碱性木聚糖酶高产菌株SX6-18,在碱性条件下可保持较高酶活,本实验为木聚糖酶在造纸及洗涤等领域的应用奠定了基础。

    2023年03期 v.36 321-329页 [查看摘要][在线阅读][下载 1081K]
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  • 急性髓系白血病FMS样酪氨酸激酶3-激酶结构域突变的高灵敏度检测方法的建立及应用

    庄晓梅;郭瑶;赵志壮;

    目的 建立一种急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3,FLT3)-激酶结构域突变(tyrosine kinase domain,TKD)的高灵敏度检测方法,并将该方法应用于AML微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)的监测。方法 构建FLT3野生型质粒和FLT3-D835Y突变型质粒,按一定比例混合后制备FLT3-D835Y突变率为50%、1%、0.1%和0%的质粒标准品,以其为检测对象,联合限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)识别法和一代测序法建立新的FLT3-TKD检测方法。用建立的方法检测含不同FLT3-D835Y突变率的质粒DNA标准品和血液样本DNA标准品,以验证方法的灵敏度;用建立的方法检测AML患者治疗前后的基因组DNA样本,以监测MRD。结果 构建的FLT3野生型质粒和FLT3-D835Y突变型质粒经测序证明构建正确。在纯化的质粒DNA和收集的血液样本DNA中,建立的方法通过一代测序结合EcoRⅤ/XhoⅠ双酶切和回收突变片段的步骤,将灵敏度提高至0.1%;用该方法在1名AML患者完全缓解期外周血样本中检测到MRD,而直接一代测序法未检测到MRD。结论 本研究开发了一种高灵敏度检测FLT3-TKD突变的方法,该方法对指导AML治疗以及监测其完全缓解期内MRD具有重要临床意义。

    2023年03期 v.36 330-335页 [查看摘要][在线阅读][下载 1017K]
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  • 实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

    毕江坤;俞露;张宇;张五妮;李利;刘涵;

    目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为:上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0~8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。

    2023年03期 v.36 336-340页 [查看摘要][在线阅读][下载 884K]
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  • 水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

    张树杰;王梦涵;朱晓文;周宏达;刘洪涛;孙跃秋;夏立新;张夫坤;

    目的 建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法 以VZV全病毒抗原为免疫原,通过小鼠杂交瘤融合技术筛选可稳定分泌抗VZV-g E抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价,经Hi Trap~(TM)Mabselect~(TM)Su Re和Hi Trap~(TM)Desalting纯化后,12%SDS-PAGE分析单克隆抗体纯度,Western blot法检测特异性,小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定亚型。经表位叠加试验筛选捕获抗体及酶标抗体,棋盘滴定法确定捕获抗体(0.25、0.5、1、2、5和10μg/m L)和酶标抗体(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000和1∶10 000稀释)工作浓度后,建立VZV-g E含量的双抗体夹心ELISA检测方法。验证方法的线性范围、准确性、精密性和特异性。采用建立的方法检测3批7 L生物反应器培养1~14 d的CHO-VZV-g E细胞培养上清中g E含量。结果共获得4株稳定分泌抗VZV-gE特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为mAb-B2、mAb-11、K9C7和K9F4,小鼠腹水抗体效价为10~6~10~7,纯化后纯度约为97%,均可与VZV全病毒蛋白发生特异性结合,轻链均为κ链,重链分别为IgG_(2b)、IgG_1、IgG_(2b)及Ig G_(2a)。确定mAb-B2作为捕获抗体,HPR标记的mAb-11作为酶标抗体,两者最佳工作浓度分别为1.5μg/mL和1∶5 000稀释。g E抗原内部参考品浓度在1.95~1 000 ng/mL范围内,与A_(450)呈良好的线性关系,四参数方程为:Y=(0.15-3.99)/[1+(X/67.4)~(1.49)]+3.99,R~2为0.999;准确性验证回收率为94.9%~114.0%;精密性验证变异系数(CV)均<15%;除CHO-VZV-gE细胞培养上清、水痘减毒活疫苗和带状疱疹减毒活疫苗外,其他检测样品的A_(450)均<0.15,无交叉反应。3批CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量随培养时间的延长逐渐升高,且在14 d内与培养时间呈正相关(R~2=0.995 6,P=0.000 1)。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的准确性、精密性和特异性,可用于VZV疫苗中g E抗原含量的快速检测。

    2023年03期 v.36 341-346页 [查看摘要][在线阅读][下载 879K]
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  • 冻干人用狂犬病疫苗原液纯度体积分子排阻高效液相色谱检测方法的建立及验证

    樊雪;汪海峰;王一平;廖辉;周隽逸;周荔葆;

    目的 建立冻干人用狂犬病疫苗原液纯度的体积分子排阻高效液相色谱(size exclusion column-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并进行验证。方法 采用TSK-gel G6000PWXL色谱柱(7.8 mm×30 cm,13μm)进行测定,流动相为:0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.8);流速为:0.5 mL/min;检测波长为:280 nm;进样量为:20μL;柱温为:30℃。验证方法的系统适用性、专属性、精密性、耐用性,并确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液及1批冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)原液的纯度。结果 参比品与两种基质制备的冻干人用狂犬病疫苗原液目的蛋白色谱峰的分离度均> 1.5,峰拖尾因子均<1.5;空白溶剂在目的蛋白出峰位置无吸收峰,不干扰测定;精密性验证中的保留时间和峰面积RSD均<2.0%;定量限为10μg/mL,检测限为4μg/mL;参比品在278、280、282 nm 3种不同检测波长下连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2.0%。4批冻干人用狂犬病疫苗原液的纯度均> 97%。结论 建立的冻干人用狂犬病疫苗原液纯度SECHPLC检测方法具有良好的专属性、精密性及耐用性,为人用狂犬病疫苗的质量控制提供了可靠方法。

    2023年03期 v.36 347-351页 [查看摘要][在线阅读][下载 841K]
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  • 基于连续流动注射安培法定量检测多糖蛋白结合疫苗中氰化物的残留量

    张姮婕;唐瑶;蒋佳兴;马晶;李炎;王叔桥;杨蕾;

    目的 建立基于连续流动注射安培法的多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的检测方法,并进行验证。方法 超滤法去除样品中的大分子物质后,采用3700全自动化学分析仪检测氰化物残留量,进样时间为:35 s;进样体积为:200μL;泵速为:40%;样品周期时间为:140 s;紫外波长为:312 nm;安培检测器。验证方法的专属性、基质效应、线性范围、检出限、定量限、准确性、精密性及稳定性。采用建立的方法检测5个厂家生产的b型流感嗜血杆菌结合疫苗及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物原液(13批)、结合物原液(21批)中氰化物残留量。结果 空白样品对检测无干扰;b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液基质效应溶液的回收率分别为97.4%、102.4%、96.8%、99.8%,CV均<15%;氰基浓度在0.312 5~80 ng/mL范围内,与峰高呈良好的线性关系,回归方程为:y=133.13 x+57.556,R~2=0.999 1;检出限为0.2 ng/mL,定量限为0.6 ng/mL;加入氰基浓度为5、10、20 ng/mL对照溶液样品的回收率均值分别为108.9%、106.5%、103.5%,RSD为6.4%;精密性验证的CV均<15%;氰基浓度为80、40、20、5 ng/mL的对照溶液连续进样20针的平均浓度分别为76、38、18、5 ng/mL,CV均<15%。13批多糖衍生物原液样品均有检出氰化物残留,21批结合物原液样品中2批未检出,其他均有检出。结论 本研究建立的方法具有良好的准确性、精密性及稳定性,可应用于多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的定量检测。

    2023年03期 v.36 352-356+362页 [查看摘要][在线阅读][下载 863K]
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综述

  • 糖尿病患者接种流感疫苗和肺炎球菌疫苗的有效性分析

    随海田;苏锦锋;舒祥;杨晓明;

    国内外权威指南、共识均建议糖尿病患者接种流感疫苗和肺炎球菌疫苗。接种流感疫苗和肺炎球菌疫苗可显著降低糖尿病患者流感和肺炎球菌性疾病发病率、住院率,还可降低心血管事件风险和死亡风险,二者联合接种保护作用更加显著。目前我国糖尿病患者流感疫苗和肺炎球菌疫苗接种率偏低,应采取有效措施促进医防融合,加强知识普及和指南宣传,提高疫苗接种率,以切实改善糖尿病患者的生存现状和预后。本文对近年来国内外糖尿病患者流感疫苗和肺炎球菌疫苗接种有效性的相关研究进展作一综述。

    2023年03期 v.36 357-362页 [查看摘要][在线阅读][下载 861K]
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  • 胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2基因与2型糖尿病相关性的研究进展

    冯珊珊;哈小琴;

    2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种多基因遗传和环境因素共同作用的慢性、非传染性疾病,其主要特征包括胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2/IMP2)作为机体一种重要的胰岛素分泌相关蛋白,其主要在胰腺、脂肪和肠道等组织细胞中表达,IGF2BP2被证实可下调IGF2的表达,与其有关的胰岛β细胞功能破坏是T2DM及血管并发症的重要原因,因此,IGF2BP2基因可作为预测糖尿病风险的重要因子之一。本文就IGF2BP2基因与T2DM之间的相关性作一综述。

    2023年03期 v.36 363-367页 [查看摘要][在线阅读][下载 875K]
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  • 细菌内毒素检测方法的研究进展

    张媛;孙述学;

    细菌内毒素作为一种强力的热原物质,极微量即可对人体健康产生严重影响,能引起发热、微循环障碍、内毒素血症、内毒素休克和弥散性血管内凝血等,严重者会造成死亡。因此,对医药产品进行内毒素检测至关重要。近年来,由于对鲎的过度捕捞以及环境的恶化等,我国鲎的数量急剧减少,现已将其列为国家二级保护动物,传统的鲎试验内毒素检测法将逐渐被替代。随着研究的不断深入,开发出一系列快速、灵敏、准确的新型内毒素检测方法。本文对各类内毒素检测方法(重点介绍了重组C因子法、生物传感器检测法等新型方法)、各自的优缺点及发展方向作一综述,以期使新型检测技术得到更广泛的开发和应用。

    2023年03期 v.36 368-372+378页 [查看摘要][在线阅读][下载 855K]
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  • 血管生成素样蛋白4在肿瘤进程中作用的研究进展

    徐金歌;王志云;杨英;

    血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4,ANGPTL4)是血管生成素家族成员之一,在脂质代谢、葡萄糖稳态、炎症信号转导以及血管生成与血管渗透性中均起到调节作用。肿瘤微环境中炎症反应调控肿瘤进程,肿瘤血管生成在肿瘤生长转移中起至关重要的作用,因此ANGPTL4与肿瘤发生发展密切相关。多项研究显示,ANGPTL4在肿瘤生长、失巢凋亡抗性、肿瘤血管生成和肿瘤转移等过程中均起到重要的调节作用。本文对ANGPTL4在肿瘤进程中的作用作一综述。

    2023年03期 v.36 373-378页 [查看摘要][在线阅读][下载 857K]
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  • 人呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

    周红军;王金伟;

    人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)是导致婴幼儿及老年人下呼吸道感染的主要病原体之一。hRSV基因组全长为15 222 bp,包含10个基因,共编码11种蛋白质(9种结构蛋白,2种非结构蛋白),不同蛋白在hRSV致病过程中发挥不同作用。随着对hRSV生物学和结构特性的深入研究,已研发出多种类型的hRSV疫苗,如hRSV减毒活疫苗hRSV?NS2/?1313/I1314L已进入Ⅱ期临床试验,hRSV亚单位蛋白疫苗Pre-F-GCN4t已进入Ⅲ期临床试验等。本文就hRSV的生物学特性及研制进展较快的hRSV疫苗类型作一综述,以期为我国hRSV疫苗的研发提供参考。

    2023年03期 v.36 379-384页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K]
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