中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

疫苗研究

  • H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞中传代稳定性的评价

    张国梅;乐洋;张哲罡;马宁;李雪丹;周蓉;贾兰馨;郑嘉昊;张家友;杨晓明;

    目的 评价H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞(sMDCK)中的传代稳定性。方法 将H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株工作种子批在sMDCK细胞中连续传15代。采用二代及一代测序法检测主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10和P15代病毒HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2 8段基因核苷酸序列的稳定性;以肽段覆盖率为指标评价工作种子批、P5、P15代病毒主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白氨基酸序列的稳定性;选取工作种子批、P5和P15代病毒制备流感疫苗,经肌内免疫雌性BALB/c小鼠,每组10只,15μg HA/只,28 d后加强免疫1次,剂量及给药途径同初次免疫,于初次免疫后28、42、56 d,检测血清中和抗体效价,评价免疫原性的稳定性。结果 各代次流感病毒均未检测到片段插入或缺失,核苷酸序列与主种子批序列完全一致;主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10代病毒均未发生单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变,但P15代病毒多个基因位点存在SNP突变的可能性,其中杂合SNP数占91.62%。P5和P15代病毒的HA、NA蛋白肽段覆盖率为96.7%~100%。初次免疫后28、42、56 d,工作种子批、P5和P15代病毒免疫小鼠血清中和抗体效价差异均无统计学意义(H分别为2.253、2.029、1.408、P分别为0.324、0.363、0.495)。结论 H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在sMDCK细胞中具有良好的遗传稳定性,有望应用于sMDCK细胞基质大流行流感疫苗的生产。

    2023年07期 v.36 769-774页 [查看摘要][在线阅读][下载 867K]
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基础研究

  • FAM84B抑制p53通路对食管鳞癌细胞增殖作用的影响

    陈菲;张亚玲;王芳;李泓漪;周延;翁泳佳;程彩霞;

    目的 研究食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中FAM84B的表达情况,及其通过p53通路对细胞生长的调控机制。方法 收集中国食管癌高发区山西省肿瘤医院及新疆医科大学附属肿瘤医院共508份ESCC肿瘤样本及其邻近正常组织样本,进行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)和外显子测序(whole exome sequencing,WES),筛选出拷贝数明显扩增的FAM84B基因。在高表达FAM84B的ESCC细胞系KYSE150中,用小干扰RNA感染法干扰FAM84B后,采用MTT和硬克隆形成试验检测FAM84B对细胞生长的影响;在低表达FAM84B ESCC细胞系KYSE450中,用质粒pCMV-3×flag-FAM84B过表达FAM84B后,采用MTT和硬克隆形成试验检测FAM84B对细胞生长的影响。采用Western blot法检测敲低FAM84B表达对细胞周期蛋白CDK4、CDK6和CCND1表达的影响。结果 对508份ESCC石蜡切片进行WGS,发现109份FAM84B基因拷贝数扩增(21.45%);FAM84B基因存在于8q24.21附近,并且存在1个显著放大的病灶峰。敲低FAM84B抑制ESCC细胞增殖,过表达FAM84B促进ESCC增殖。FAM84B低表达促进p53介导的细胞周期进行。结论 FAM84B通过抑制ESCC细胞p53通路蛋白的表达,促进细胞周期由G1期向S期转化,进而促进细胞增殖。

    2023年07期 v.36 775-780页 [查看摘要][在线阅读][下载 979K]
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  • 6种转录本人早幼粒细胞性白血病基因真核表达质粒的构建及其重组蛋白的亚细胞定位分析

    蔺玉刚;马春玲;杨雪;龚真莉;岳亚辉;王芳萍;郜晓虹;任善会;孙跃峰;陈豪泰;焦海宏;

    目的 构建6种转录本人早幼粒细胞性白血病(human promyelocytic leukaemia,hPML)基因的真核表达质粒,并分析其重组蛋白的亚细胞定位情况。方法 根据GenBank中登录的hPML基因序列设计引物,RT-PCR法扩增获得6种转录本hPML基因片段(hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ),分别连接至真核表达载体pCAGGS,获得6种转录本hPML基因的真核表达质粒。将6种真核表达质粒分别转染293T细胞,Western blot法检测蛋白表达情况;分别转染至Vero细胞,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)法检测亚细胞定位情况。结果 6种真核表达质粒中的目的基因片段均与GenBank中登录的hPML基因序列一致。6种重组蛋白均可与Myc抗体发生特异性结合,其中重组蛋白hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ定位于细胞核及细胞质内,重组蛋白hPMLⅦ主要定位于细胞质,极少定位于细胞核中。结论构建的6种转录本hPML基因真核表达质粒均可在哺乳动物细胞中正确表达,表达的重组蛋白同时定位于细胞核及细胞质或主要定位于细胞质中。本研究为重组蛋白hPML抗病毒等生物学功能的深入研究提供了实验依据。

    2023年07期 v.36 781-785页 [查看摘要][在线阅读][下载 971K]
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  • 长链非编码RNA MALAT1对甲状腺癌细胞生长和侵袭的影响及其作用机制

    王瑾琳;郑晨;魏晓霞;高岚;

    目的 评价长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)MALAT1对甲状腺癌细胞生长及侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法 采用定量PCR法检测44例甲状腺癌患者癌组织及癌旁组织中MALAT1和miR-211-5p基因的相对表达水平,相同方法检测SW1736、TC1和Hth7及Nthy-ori 3-1细胞中MALAT1基因的相对表达水平。MTT法检测MALAT1对甲状腺癌细胞生存能力的影响(SW1736细胞分别转染pcDNA3.1-MALAT1、pcDNA3.1、si-MALAT1、si-NC),相同方法检测过表达miR-211-5p对MALAT1诱导甲状腺癌细胞高生存能力的影响(SW1736细胞分别转染pcDNA3.1-MALAT1、miR-211-5p mimics、Scramble及pcDNA3.1-MALAT1+miR-211-5p mimics)。Transwell小室试验检测MALAT1对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响(SW1736细胞分别转染si-NC、si-MALAT1、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MALAT1、miR-211-5p mimics及miR-211-5p mimics+pcDNA3.1-MALAT1)。定量PCR法检测MALAT1对miR-211-3p表达的调控作用(SW1736细胞分别转染pcDNA3.1-MALAT1、pcDNA3.1、si-MALAT1、si-NC)。结果 与癌旁组织比较,44份甲状腺癌组织样本中,37份MALAT1基因相对表达水平增高(占84.1%),39份miR-211-5p基因相对表达水平降低(占88.6%),两者的表达水平呈负相关(r2=0.168,P=0.005 7)。与Nthy-ori 3-1细胞比较,SW1736、TC1、Hth7细胞中MALAT1基因相对表达水平明显增加(t分别为10.230、5.813、74.310,P分别为0.009、0.004、<0.001)。转染72 h后,与si-NC组比较,si-MALAT1组SW1736细胞的生长能力明显降低(t=7.780,P=0.001),pcDNA3.1-MALAT1组明显升高(t=-7.410,P=0.002);与pcDNA3.1-MALAT1组比较,pcDNA3.1-MALAT1+miR-211-5p mimics组SW1736细胞生长能力明显下降(t=-5.640,P=0.005)。与si-NC组比较,si-MALAT1及miR-211-5p mimics组SW1736细胞发生侵袭的细胞数明显减少(t分别为-6.710和-6.290,P均=0.003),pcDNA3.1-MALAT1组则明显增多(t=5.740,P=0.005)。与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-MALAT1组细胞中miR-211-5p基因相对表达水平明显降低(t=-7.510,P=0.002);与si-NC组比较,si-MALAT1组则明显增加(t=7.960,P=0.001)。结论 干扰lncRNA MALAT1的表达可有效抑制甲状腺癌细胞的增殖和转移,可能是通过上调miR-211-5p的表达水平实现的,MALAT1有望成为治疗甲状腺癌的潜在分子靶点。

    2023年07期 v.36 786-792页 [查看摘要][在线阅读][下载 1131K]
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  • 融合卷曲螺旋结构域的蔗糖异构酶活性包涵体异源表达及其酶学性质

    马志宇;高向红;庞焦;刘羽欣;李明玉;王从纲;李宪臻;

    目的 融合表达源自细胞表面蛋白tetrabrachion的四聚化卷曲螺旋结构域(tetrameric coiled-coil domain of the cell-surface protein tetrabrachion,TdoT)的蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SI),并研究其重组酶的酶学性质。方法 分别将TdoT与SI的N/C-端融合,构建重组表达载体pET-24a-TdoT-SI和pET-24b-SI-TdoT,转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,纯化重组酶后进行酶学性质表征和产物特异性研究。结果 TdoT-SI和SI-TdoT表达为具有催化活性的包涵体,而未融合TdoT的SI包涵体则无催化活性。酶学性质表征结果显示,TdoT-SI和SI-TdoT活性包涵体的最适反应温度均为40℃,最适反应pH分别为5.5和5.0。TdoT-SI活性包涵体的动力学常数K_m为(103.9±9.5)mmol/L,k_(cat)/K_m为(0.06±0.002)L/(mmol·s);SI-TdoT活性包涵体的动力学常数K_m为(54.4±6.6)mmol/L,k_(cat)/K_m为(0.03±0.002)L/(mmol·s)。产物特异性分析结果显示,随着反应温度升高,产物中异麦芽酮糖含量并未出现较大变化,而产物中海藻酮糖含量随转化反应温度升高而降低,同时单糖的含量随转化反应温度升高而增加。结论 通过融合表达技术成功制备出融合卷曲螺旋结构域的SI活性包涵体,其作为一种新型自固定化酶,具有同步实现表达和固定化的优势,为实现重组SI的规模化制备和高效利用提供了新策略。

    2023年07期 v.36 793-799页 [查看摘要][在线阅读][下载 880K]
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  • 高表达花烟草防御素1基因K326烟草叶片总蛋白的提取及其生物活性分析

    龚伟伟;黄小贞;赵懿琛;

    目的 提取高表达花烟草防御素1(Nicotiana alata defensin 1,NaD1)基因的K326烟草叶片总蛋白,并分析其生物活性。方法 从花烟草花、野生型(WT)和高表达NaD1基因(转基因)K326烟草叶片中提取总蛋白,Bardford法测定蛋白浓度。滤纸片法检测总蛋白对真菌的抑菌活性,CCK-8法检测对癌细胞(HeLa细胞)的抑制活性。结果 花烟草花、WT及转基因K326烟草叶片总蛋白浓度分别为11.25、10.33和10.14 mg/mL。转基因K326烟草叶片总蛋白对白色念珠菌的抑菌活性为(85.68±3.08)%,分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.33和1.14倍(F=15 339,P <0.05);对尖孢镰刀菌的抑菌活性为(148.48±2.47)%,分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.09和1.08倍(F=4 927,P <0.05)。转基因K326烟草叶片总蛋白对HeLa细胞的IC_(50)最小(6.11 mg/mL),抑制活性分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.56和1.21倍(F=89 748,P <0.05)。结论 高表达NaD1基因的K326烟草总蛋白具有良好的抑菌和抗癌生物活性,本研究为以烟草作为生物反应器生产抑菌和抗癌生物制剂提供了实验依据。

    2023年07期 v.36 800-804页 [查看摘要][在线阅读][下载 851K]
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治疗制剂

  • 胰岛素调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1信号通路对急性肺损伤小鼠肺水肿的清除作用

    邓欣雨;罗晓庆;童瑾;王导新;邓旺;

    目的 探讨胰岛素通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(serine/threonine protein kinase-1,SGK1)减轻急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠肺水肿的机制。方法 将32只雄性成年C3H/HeN小鼠随机分为对照组(仅泵入与治疗组等量的生理盐水)、ALI组(建模后持续泵入与治疗组等量的生理盐水)、治疗组[建立ALI模型后,持续经颈静脉泵入胰岛素0.1 U/(kg·h)]和SGK1 siRNA组[建立ALI模型后,持续泵入胰岛素0.1 U/(kg·h)的同时,给予SGK1 siRNA(75μg SGK1 siRNA稀释于100μL生理盐水中)],每组8只。8 h后处死小鼠,进行动脉血气分析(模型建立1 h后),并检测血糖变化情况(0、1、4、8 h);收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),检测其中总蛋白含量,并测定肺泡上皮通透性和肺水含量;观察肺组织病理学改变和肺上皮细胞凋亡情况;Western blot法测定肺泡上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)和α_1-钠/钾ATP酶(α_1-Na~+,K~+-ATPase)蛋白表达以及SGK1磷酸化水平。结果 泵入胰岛素后0、1、4、8 h,ALI与治疗组小鼠血糖水平差异均无统计学意义(t分别为1.330 0、0.986 0、0.565 7和0.724 3,P分别为0.204 7、0.340 7、0.580 6和0.480 8)。与ALI组比较,治疗组小鼠动脉血氧分压显著升高(t=6.026,P <0.000 1),BALF蛋白含量、肺泡上皮通透性、肺水含量和肺上皮细胞凋亡显著减少(t分别为7.39、5.286、5.651和3.312,P分别为<0.000 1、0.000 4、0.000 2和0.007 8),肺组织中α-ENaC和α_1-Na~+,K~+-ATPase蛋白表达及SGK1磷酸化水平显著升高(t分别为26、18.67和8.547,P分别为<0.000 1、<0.000 1和0.000 1);与治疗组比较,SGK1 siRNA组小鼠BALF蛋白含量、肺泡上皮通透性、肺水含量和肺上皮细胞凋亡显著增加(t分别为5.964、3.449、3.148和3.520,P分别为0.000 2、0.006 2、0.010 4和0.016 9),α-ENaC和α_1-Na~+,K~+-ATPase蛋白表达及SGK1磷酸化水平显著降低(t分别为13、9.874和7.741,P分别为<0.000 1、<0.000 1和0.001 5)。结论 外源性胰岛素能减轻ALI小鼠的肺水肿,其机制可能是通过SGK1上调α-ENaC和α_1-Na~+,K~+-ATPase的表达实现。

    2023年07期 v.36 805-809+814页 [查看摘要][在线阅读][下载 1034K]
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临床研究

  • 重组人干扰素α2a栓对人乳头瘤病毒感染患者宫颈黏液中炎性因子水平的影响

    陈庆;张妮;胡晓琴;张欣;谢秀英;

    目的 探讨重组人干扰素α2a(recombinant human interferon α2a,rhIFNα2a)栓对人乳头瘤病毒(huaman papillo-mavirus,HPV)感染患者宫颈黏液中炎性因子水平的影响。方法 选取西安交通大学第二附属医院2022年3—8月收治的60例HPV阳性患者作为研究对象,按照随机数字表法分为观察组和对照组,每组30例。观察组给予rhIFNα2a栓治疗,阴道用药,隔日1次,1个月连用10次为1个疗程,持续3个疗程;对照组不使用药物。收集宫颈分泌物,采用化学发光法检测IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。结果 治疗3个月后,观察组患者宫颈黏液中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平明显低于对照组(t分别为-2.717、-2.686、-3.178、-3.25,P均<0.05)。与治疗前相比,观察组患者宫颈黏液中IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平明显降低(t分别为5.934、4.092、6.495、3.287,P均<0.01),而对照组患者宫颈黏液中仅IL-8水平差异有统计学意义(t=2.345,P=0.024)。结论 rhIFNα-2a栓治疗可降低宫颈黏液中炎性因子水平,改善炎性反应,加快HPV清除。

    2023年07期 v.36 810-814页 [查看摘要][在线阅读][下载 812K]
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  • 2014—2020年福建省非免疫规划疫苗使用情况监测分析

    王琴;陈俊磊;潘伟毅;

    目的 对2014—2020年福建省非免疫规划(non-national immunization program,nNIP)疫苗的使用情况进行监测分析,为加强nNIP疫苗接种服务管理提供参考。方法 从“中国免疫规划信息管理系统”提取2014—2020年nNIP疫苗接种数据,采用描述性流行病学方法进行分析。结果 2014—2020年福建省nNIP疫苗共接种28 835 834剂次,人均接种剂次数为1 015剂次/万人,使用的种类从22种增加至28种。nNIP疫苗使用量、占所有疫苗接种总剂次比例、人均接种剂次数基本呈逐年递增趋势。使用量较多的品种主要有水痘减毒活疫苗(varicella attenuated live vaccine,VarV)、乙型肝炎(hepatitis B,HepB)疫苗、人用狂犬病疫苗(rabies vaccine for human use,RabV)、b型流行性感冒(流感)嗜血杆菌(haemophilus influenza type b,Hib)多糖结合疫苗、流感疫苗(influenza vaccine,InfV)、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗。替代率最高的3种疫苗为甲肝疫苗、A群流脑疫苗、A群C群流脑疫苗,替代率分别为22.42%、10.32%、9.89%。结论 福建省nNIP疫苗使用的种类、数量越来越多,需进一步加强监测与管理,完善接种服务。

    2023年07期 v.36 815-819页 [查看摘要][在线阅读][下载 834K]
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  • 2015—2022年吉林省不同月龄儿童接种麻腮风/麻风疫苗的安全性分析

    曹凤瑞;付思美;程涛;李春梅;武懿;李永强;王爽;

    目的 分析2015—2022年吉林省不同月龄儿童接种麻腮风/麻风疫苗的安全性。方法 通过吉林省免疫规划信息管理系统收集2015年1月1日—2022年12月31日麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗(measles,mumps and rubella combined attenuated live vaccine,简称MMR)及麻疹、风疹联合减毒活疫苗(measles and rubella combined attenuated live vaccine,简称MR)的实际接种数据,并经全国疑似预防接种异常反应(adverse event following immunization,AEFI)监测报告系统收集该时间段内接种MMR和MR后报告的所有AEFI个案信息。比较8月龄儿童接种第1剂次MMR(MMR8组)及MR(MR8组)、18月龄儿童接种第1剂次MMR(8月龄时接种MR,MMR18-1组)及第2剂次MMR(8月龄时接种第1剂次MMR,MMR18-2组)后的AEFI报告发生率,初步评价不同月龄儿童接种MMR及MR的安全性。结果MMR8、MR8、MMR18-1和MMR18-2组的AEFI报告发生率分别为374.41/10万、350.81/10万、101.70/10万和104.91/10万,4组间差异有统计学意义(χ~2=1 145.47,P=0.00);MMR8与MR8组、MMR18-1与MMR18-2组间差异均无统计学意义(χ~2分别为3.780和0.194,P均> 0.05);MMR8与MMR18-1、MMR8与MMR18-2、MR8与MMR18-1组间差异均有统计学意义(χ~2分别为920.440、412.110、1 021.120,P均<0.001)。不良反应大部分为一般反应,以发热、局部红肿和硬结为主;少数为异常反应,以过敏性反应(皮疹、丘疹和荨麻疹等)为主。仅MMR8组报告1例偶合症,未发生心因性反应、疫苗质量事故、接种事故。所有AEFI转归均为好转或痊愈。结论 8月龄儿童接种MMR及MR的AEFI报告发生率差异均较小,且无论初次接种MMR还是MR,18月龄儿童复种MMR的AEFI发生率差异均较小。8月龄儿童使用MMR替代MR进行初次接种安全性良好。

    2023年07期 v.36 820-825页 [查看摘要][在线阅读][下载 847K]
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技术方法

  • 双重数字PCR法评价Luc2P系列报告基因细胞系的稳定性

    于雷;王光裕;裴德宁;安怡方;史新昌;周勇;

    目的 建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法 提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性。结果 未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10%,Luc和RPP30的线性拟合R~2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50%~100%之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致。该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致。结论 建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价。

    2023年07期 v.36 826-832+838页 [查看摘要][在线阅读][下载 1168K]
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  • 肠道出血性大肠埃希菌菌株及其基因组DNA标准物质的研制及评价

    刘娜;王亚萍;赵琳娜;王学硕;崔生辉;

    目的 筛选肠道致病性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)菌株,并将其申报为中国医学细菌保藏管理中心(China Medical Bacterial Species Conservation and Management Center,CMCC)标准菌株;以此标准菌株研制我国自主知识产权的EHEC菌株及其基因组DNA标准物质,并将其申报为国家药品标准物质。方法 依据GB4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》,从160株来源于腹泻患者的大肠埃希菌中筛选EHEC菌株,按照CMCC菌株管理规定整理材料将其申报为标准菌株。用其制备EHEC菌液及其基因组DNA溶液,采用冷冻干燥技术分别制备菌株类(103CFU/样品)和基因组DNA类(20 ng/样品)样品各600个。将这两种样品各随机抽取20个进行均匀性检验;并分别于25、37℃条件下存放1、3、5、7 d取样检测运输稳定性,于4℃条件下存放7、14、28 d取样检测短期保存稳定性,于-20℃条件下存放14、28、60 d取样检测长期保存稳定性。组织3家实验室对两种样品进行协同标定。筛选20种食品基质对菌株样品进行使用效果评价。结果 从160株来源于患者的大肠埃希菌中筛选出1株EHEC菌株,最终申报为CMCC(B)43207标准菌株。均匀性检验中,F_(菌株样品)=0.662 <F_(INV)(0.05,19,20),P> 0.05;20个基因组样品的eae、stx1、stx2基因均为阳性。于25和37℃保存7 d、-20℃保存60 d、4℃保存28 d后,菌株样品活菌含量均为10~3CFU/样品,基因组样品的eae、stx1、stx2基因均为阳性。随机抽取的EHEC菌株和基因组DNA样品经3家实验室鉴定均为EHEC,活菌含量均在10~3CFU/样品的水平,且eae、stx1、stx2基因均为阳性。在20种食品基质中加入样品后均可检出,本底对照均未检出。EHEC菌株及其基因组DNA样品均纳入我国药品标准物质,编号分别为80024和80056。结论 研制的具有自主知识产权的EHEC菌株及其基因组DNA标准物质可提高EHEC检验的时效性,弥补了我国此方面空白。

    2023年07期 v.36 833-838页 [查看摘要][在线阅读][下载 850K]
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  • SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法的建立及验证

    程小玲;施金荣;张雪婷;申瑷琳;何婧雯;程尧;段凯;

    目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性。方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液进行DNA提取,采用探针型PCR对宿主细胞DNA残留量进行定量分析。对建立的方法进行线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性、准确度验证,并使用该方法对5批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)进行宿主细胞DNA残留量检测。结果 DNA标准曲线在300~0.003 pg/μL范围内线性良好(R~2均≥0.99);重复性和中间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20%;定量限为0.001 pg/μL;样品稀释液与纯化液稀释液对检测无干扰;样品于53、55、57℃条件下孵育60 min及55℃条件下孵育56、60、64 min的检测结果无明显差异;准确度验证回收率在79%~83%,RSD <5%。用该方法检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液中DNA残留量适应性良好。结论 成功建立了SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,该方法线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性和准确度均符合可接受标准,适用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量的检测及质量控制。

    2023年07期 v.36 839-843页 [查看摘要][在线阅读][下载 823K]
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  • 重组蛋白中甘氨酸、组氨酸含量柱前衍生反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

    张小雪;梁舒静;王惠欣;王辉;

    目的 建立定量检测重组蛋白中甘氨酸、组氨酸含量的柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC),并进行验证。方法 选用AccQ Tag-C18(3.9 mm×150 mm,4μm)色谱柱,以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate,AQC)为柱前衍生化试剂,α-氨基丁酸为内标,AccQTag Eluent A液、乙腈溶液、超纯水为流动相,紫外检测波长为248 nm,进样量为10μL,流速为1.0 mL/min,柱温为37℃。内标法计算样品中甘氨酸、组氨酸含量,并对该方法专属性、线性、检测限、定量限、精密度、准确度和稳定性进行验证。结果 建立的方法可将甘氨酸、组氨酸和内标α-氨基丁酸有效分离,专属性强。甘氨酸在2.25~11.25μg/mL范围内,组氨酸在72.85~364.24μg/mL范围内,标准曲线线性良好,R~2均>0.99。检测限为:甘氨酸2.25μg/mL,组氨酸18.21μg/mL。定量限为:甘氨酸4.69μg/mL,组氨酸32.86μg/mL。甘氨酸、组氨酸同浓度6份样品重复性验证结果的RSD分别为4.6%和5.0%,中间精密度试验回收率的RSD分别为6.9%和2.0%。甘氨酸含量接近定量限,其高、中、低浓度样品平均回收率为75.9%~111.7%;组氨酸回收率为88.9%~97.3%。同1份样品在0、12、18、24、30、48 h甘氨酸含量的RSD为7.7%,组氨酸含量的RSD为3.3%。结论 柱前衍生RP-HPLC法精密度高,结果准确可靠,可对重组蛋白中的甘氨酸、组氨酸含量进行质量控制。

    2023年07期 v.36 844-849页 [查看摘要][在线阅读][下载 832K]
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  • 卵清蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

    李妮;朱文勇;宋绍辉;马磊;高菁霞;廖国阳;李卫东;

    目的 建立卵清蛋白(ovalbumin,OVA)双抗体夹心ELISA检测方法并进行验证,以用于流感疫苗中OVA含量的测定。方法 以兔抗OVA多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的兔抗OVA多克隆抗体作为检测抗体建立OVA双抗体夹心ELISA检测方法。对包被抗体浓度(2、1、0.5、0.25μg/mL)、酶标抗体浓度(0.5、0.25、0.125μg/mL)、封闭液(1%BSA、2%BSA、1%BSA+1%蔗糖、2%BSA+2%蔗糖,以未封闭为对照)进行优化,并确定Cut-off值作为判断标准。对方法的线性范围及检测下限、特异性、重复性和准确度进行验证。结果 该方法的最适检测条件为:包被抗体浓度1μg/mL,酶标抗体浓度0.25μg/mL;封闭液为2%BSA+2%蔗糖;Cut-off值为0.051 66。该方法线性范围为5~0.313 ng/mL,检测下限为0.078 ng/mL;与流感病毒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、Vero细胞上清液等均不发生反应;板内变异系数(CV)在2.562%~13.887%之间,板间CV在4.000%~16.497%之间;该方法检测结果与德国SERAMUN OVA定量检测试剂盒检测结果的符合率在93.79%~107.05%之间。结论 建立的OVA双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性、重复性、线性范围及准确度,且操作简便、成本低,可用于OVA的定量检测。

    2023年07期 v.36 850-854+861页 [查看摘要][在线阅读][下载 846K]
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  • NMM肿瘤DNA疫苗乙二胺四乙酸二钠残留量高效液相色谱检测方法的建立及验证

    孙澳;郭润姿;田园;伊君梅;柯尊阳;宋卫卫;邱创钧;李忠明;王宇;于继云;

    目的 建立NMM肿瘤DNA疫苗原液中乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)残留量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并进行验证,用于DNA疫苗质量控制。方法 将NMM肿瘤DNA疫苗原液与硫酸铜络合后,建立EDTA-2Na残留量HPLC检测方法:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为水-10%四丁基氢氧化铵-乙腈溶液(74.5∶0.5∶25);检测波长为254 nm;流速为0.8 mL/min;柱温为20℃;进样量为20μL。对方法的专属性、线性范围、检测限及定量限、溶液稳定性、耐用性、准确度、精密度进行验证。用建立的方法对多批次DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量进行检测。结果EDTA-2Na对照品及加入EDTA-2Na的DNA疫苗原液与硫酸铜反应后,在5.3 min附近出现吸收峰,而DNA疫苗原液与硫酸铜反应后未见吸收峰;对照品在4~400μg/mL范围内,与峰面积呈良好的线性关系,R~2=0.999 9;该方法检测限为10 ng/mL,定量限为40 ng/mL;对照品及供试品溶液放置12 h,溶液稳定性良好;方法检测条件发生微小变动时(不同流动相比例、不同流速、不同柱温),对检测结果的影响在可接受范围内;低、中、高浓度加标样品EDTA-2Na回收率均值为101.38%,RSD为0.39%;0.1 mg/mL对照品溶液连续进样6次,峰面积RSD为0.04%,6份供试品溶液均未检出EDTA-2Na,含EDTA-2Na的供试品溶液峰面积RSD为0.02%,中间精密度良好。多批次DNA疫苗原液均未检测出EDTA-2Na残留。结论 建立的方法操作简便,准确可靠,专属性强,可用于DNA疫苗原液中EDTA-2Na残留量检测。

    2023年07期 v.36 855-861页 [查看摘要][在线阅读][下载 896K]
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综述

  • MF59佐剂在流感疫苗中的作用机制及其应用进展

    宿诺;吴业红;张雪梅;

    流感疫苗接种是预防流感病毒传播最有效的途径,在流感疫苗中添加佐剂不仅能增强机体免疫应答反应,还可节省抗原剂量。除经典铝佐剂外,MF59佐剂作为第2个上市且已广泛应用于人体疫苗的佐剂,其诱导抗体的能力不仅与铝佐剂相当,甚至还可诱导细胞免疫应答,募集免疫类细胞,更好地提高疫苗有效性。本文对MF59佐剂在流感疫苗中的作用机制及其应用进展作一综述,并对其进一步发展进行分析和探讨。

    2023年07期 v.36 862-867页 [查看摘要][在线阅读][下载 830K]
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  • 治疗性抗体免疫原性的研究进展

    于兴艳;李涛;杨毅;

    治疗性抗体在临床上获得了理想效果,但抗体药物的免疫原性可能引发机体抗药物免疫反应,从而诱导抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)的产生。ADA通过中和/非中和药物活性,影响药物的清除和生物利用度,改变药物药代动力学和药效学特性。在临床中,ADA可干扰或阻断药物的治疗效果,并可能导致不同程度的不良反应;在临床前研究中,ADA可干扰候选分子的有效性评价和筛选。本文就影响治疗性抗体免疫原性的因素、ADA的类型及形成机制、ADA的检测方法、降低免疫原性的方法及针对高免疫原性药物的临床前动物模型研发作一综述,以期为治疗性抗体的研发提供参考。

    2023年07期 v.36 868-873页 [查看摘要][在线阅读][下载 829K]
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  • 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子在化疗后中性粒细胞减少症中的临床应用价值

    魏浩旗;冯学乾;刘海鹏;陈晓;

    恶性肿瘤患者化疗过程中,中性粒细胞减少症是骨髓抑制性化疗药物引起的最主要不良事件,其减少程度和持续时间与患者感染风险甚至死亡风险密切相关。粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)是一种内源性造血生长因子,可刺激中性粒细胞前体的增殖和分化,并增加成熟中性粒细胞的存活率和活性。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-colony stimulating factor,rhG-CSF)是一种人工合成的具有G-CSF生物活性的细胞因子,临床用于细胞毒类化疗药物治疗后出现的中性粒细胞减少症的预防和治疗,但其半衰期短,应用过程中需多次用药,反复注射。聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(pegylated recombinant human granulocyte-colony stimulating factor,PEG-rhG-CSF)是其长效剂型,患者化疗每周期仅需1次给药,因其稳定、方便的优点已广泛应用于临床。本文对PEG-rhG-CSF在化疗后中性粒细胞减少症中的临床应用价值作一综述,旨在为其进一步临床应用提供参考。

    2023年07期 v.36 874-882页 [查看摘要][在线阅读][下载 928K]
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  • 老年人预防性疫苗研发策略

    严孝金;耿芸;段清堂;

    面向老年人的疫苗接种越来越受到全社会的重视。新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)导致的死亡病例多为老年人,尤其是患有基础性疾病的老年人,接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗被证明在预防重症和死亡方面对老年人有显著的保护效果。目前我国老年人疫苗接种率较低,从受众端主要有疫苗科普教育不普及、主动接种意愿不足等因素,从供给端主要有缺少适用于老年人的疫苗、疫苗售价较高等因素。本文就目前我国针对老年人疫苗的市场状况和研发进展以及老年人基础性疾病、免疫衰老和既往感染史/接种史对疫苗安全性和有效性的影响作一综述,从应用新型佐剂提高疫苗免疫原性、根据老年人免疫应答的特点优化疫苗临床前研究评价标准、注重提升细胞免疫应答以及开发口服和吸入等接种途径的疫苗等方面探讨了面向老年人疫苗研发的策略。

    2023年07期 v.36 883-891页 [查看摘要][在线阅读][下载 901K]
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专题报道

  • 生物制品连续制造技术应用质量控制的相关思考

    赵欣;韦薇;

    <正>药品连续制造(continuous manufacturing,CM)是制药工业的先进技术体系应用,是制药技术的不断创新,有助于改进药品设计和生产工艺,提高药品质量,形成更加稳定、成本更低的供应链。药品CM有助于确保产品具有良好的均一性,使生产企业能快速扩大生产规模以满足市场需求;药品CM中的新技术可以采用较小的生产设施和设备即可完成生产,这些高科技属性可以促进药品生产行业的发展;

    2023年07期 v.36 892-896页 [查看摘要][在线阅读][下载 825K]
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