中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

疫苗研究

  • 表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

    宋泽鑫;周艳;林晓晨;赵永美;施鹏;王学付;张朝武;李鸿钧;

    目的 构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法 将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×109copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果 重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论 成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1025-1031页 [查看摘要][在线阅读][下载 936K]
    [下载次数:222 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

    宋泽鑫;周艳;林晓晨;赵永美;施鹏;王学付;张朝武;李鸿钧;

    目的 构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法 将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×109copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果 重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论 成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1025-1031页 [查看摘要][在线阅读][下载 936K]
    [下载次数:222 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]

基础研究

  • 过表达碳青霉烯酶OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体信号通路的影响

    潘亚菲;赵志军;党甜甜;康宇婷;贾伟;

    目的 探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的影响。方法 将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至E.coli BL21(DE3)中,获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定。以A_(600)(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)及诱导时间(2、4、6 h)为变量,mRNA转录水平为响应值,设计3因素3水平正交试验,优化质粒的诱导表达条件。纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南(Imipenem,IPM)、美罗培南(Meropenem,MEM)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)的耐药性;通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性。将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-кB(p65)基因mRNA转录水平,ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况。结果 经菌落PCR及测序鉴定,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确。最佳诱导条件:A_(600)为0.3,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为2 h。与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低(t=7.14~22.32,P均<0.05),形成的生物膜明显增多(t=15.69,P <0.05),在血清中的存活率显著升高(P <0.05);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞24 h后,TLR2基因mRNA转录水平显著增加(t=5.77,P <0.05),感染12及24 h后,TLR4、NF-кB(p65)基因mRNA转录水平显著增加(t=3.71~10.06,P <0.05)。与正常细胞组相比较,pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞6、12和24 h后,IL-6及TNF-α的表达水平显著升高(t分别为7.90~13.44及5.40~6.32,P均<0.01),IL-10表达水平显著下降(t=3.15~4.08,P均<0.05),TGF-β的表达水平差异无统计学意义(t=0.013~1.41,P均> 0.05);感染12和24 h时,IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组(t分别为2.92和3.79,P均<0.05)。结论 过表达OXA-48可降低细菌的耐药性,提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平,还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平。

    2023年09期 v.36 1032-1038页 [查看摘要][在线阅读][下载 982K]
    [下载次数:65 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 过表达碳青霉烯酶OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体信号通路的影响

    潘亚菲;赵志军;党甜甜;康宇婷;贾伟;

    目的 探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的影响。方法 将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至E.coli BL21(DE3)中,获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定。以A_(600)(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)及诱导时间(2、4、6 h)为变量,mRNA转录水平为响应值,设计3因素3水平正交试验,优化质粒的诱导表达条件。纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南(Imipenem,IPM)、美罗培南(Meropenem,MEM)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)的耐药性;通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性。将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-кB(p65)基因mRNA转录水平,ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况。结果 经菌落PCR及测序鉴定,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确。最佳诱导条件:A_(600)为0.3,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为2 h。与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低(t=7.14~22.32,P均<0.05),形成的生物膜明显增多(t=15.69,P <0.05),在血清中的存活率显著升高(P <0.05);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞24 h后,TLR2基因mRNA转录水平显著增加(t=5.77,P <0.05),感染12及24 h后,TLR4、NF-кB(p65)基因mRNA转录水平显著增加(t=3.71~10.06,P <0.05)。与正常细胞组相比较,pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞6、12和24 h后,IL-6及TNF-α的表达水平显著升高(t分别为7.90~13.44及5.40~6.32,P均<0.01),IL-10表达水平显著下降(t=3.15~4.08,P均<0.05),TGF-β的表达水平差异无统计学意义(t=0.013~1.41,P均> 0.05);感染12和24 h时,IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组(t分别为2.92和3.79,P均<0.05)。结论 过表达OXA-48可降低细菌的耐药性,提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平,还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平。

    2023年09期 v.36 1032-1038页 [查看摘要][在线阅读][下载 982K]
    [下载次数:65 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • Ⅲ型登革病毒感染THP-1细胞及其介导的抗体依赖性增强感染中差异性LncRNA的CeRNA网络构建

    龙明望;王涵;张丽;贾凡;刘燕会;宁雪磊;陈俊英;潘玥;孙强明;

    目的 在急性单核细胞白血病细胞(THP-1)水平建立Ⅲ型登革病毒(Dengue virus typeⅢ,DENV-3,DV-3)感染和抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)感染模型,探讨胞内长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的差异性表达,绘制竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,CeRNA)调控网络并进行LncRNA翻译功能预测。方法 DENV-3感染C6/36细胞6 d后,收获培养上清,采用CCID50法测定病毒滴度,并通过PCR进行型别以及基因组全长扩增鉴定;扩增DENV-3标准质粒,PCR鉴定,绘制标准曲线;将THP-1细胞分为阴性对照(THP-1)、直接感染(DV-3)、ADE及空白对照[1640(-)]组,感染48 h后提取胞内总RNA,测定病毒拷贝数;通过全转录组测序技术,对THP-1 vs DENV-3、THP-1 vs ADE、DENV-3 vs ADE各组中上调和下调前5个的LncRNA进行CeRNA调控网络构建,并分析其编码蛋白的功能。结果 DENV-3感染C6/36细胞3 d后有明显的细胞融合、空泡和脱落;病毒滴度约为1.0×104.64PFU/mL,PCR特异引物鉴定为DENV-3,获得病毒完整的基因序列;ADE组胞内病毒核酸拷贝数明显高于DV-3组和空白对照组;在THP-1 vs DENV-3中,预测到人细胞黏附蛋白相互作用蛋白(cytohesin interacting protein,CYTIP)的表达量出现上调;在THP-1 vs ADE中,预测到驱动蛋白家族成员5A(kinesin family 5A,KIF5A)的表达量下调;在DENV-3 vs ADE中,预测到簇分化抗原9(cluster differentiation antigen 9,CD9)和胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)的表达量上调。这些差异性的LncRNA均具有开放阅读框(open reading frame,ORF),除了Lnc-SH3BP1和Lnc-RPL41以外,其余的LncRNA均具有内部核糖体结合位点(internal ribosome binding site,IRES)。结论 在DENV-3感染THP-1细胞及其介导的ADE感染中,LncRNA的表达发生了明显的差异性改变,且可能通过多种生物学功能调控感染的进程,有助于更深层次理解ADE感染的发生机制。

    2023年09期 v.36 1039-1046+1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1046K]
    [下载次数:107 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • Ⅲ型登革病毒感染THP-1细胞及其介导的抗体依赖性增强感染中差异性LncRNA的CeRNA网络构建

    龙明望;王涵;张丽;贾凡;刘燕会;宁雪磊;陈俊英;潘玥;孙强明;

    目的 在急性单核细胞白血病细胞(THP-1)水平建立Ⅲ型登革病毒(Dengue virus typeⅢ,DENV-3,DV-3)感染和抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)感染模型,探讨胞内长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的差异性表达,绘制竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,CeRNA)调控网络并进行LncRNA翻译功能预测。方法 DENV-3感染C6/36细胞6 d后,收获培养上清,采用CCID50法测定病毒滴度,并通过PCR进行型别以及基因组全长扩增鉴定;扩增DENV-3标准质粒,PCR鉴定,绘制标准曲线;将THP-1细胞分为阴性对照(THP-1)、直接感染(DV-3)、ADE及空白对照[1640(-)]组,感染48 h后提取胞内总RNA,测定病毒拷贝数;通过全转录组测序技术,对THP-1 vs DENV-3、THP-1 vs ADE、DENV-3 vs ADE各组中上调和下调前5个的LncRNA进行CeRNA调控网络构建,并分析其编码蛋白的功能。结果 DENV-3感染C6/36细胞3 d后有明显的细胞融合、空泡和脱落;病毒滴度约为1.0×104.64PFU/mL,PCR特异引物鉴定为DENV-3,获得病毒完整的基因序列;ADE组胞内病毒核酸拷贝数明显高于DV-3组和空白对照组;在THP-1 vs DENV-3中,预测到人细胞黏附蛋白相互作用蛋白(cytohesin interacting protein,CYTIP)的表达量出现上调;在THP-1 vs ADE中,预测到驱动蛋白家族成员5A(kinesin family 5A,KIF5A)的表达量下调;在DENV-3 vs ADE中,预测到簇分化抗原9(cluster differentiation antigen 9,CD9)和胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)的表达量上调。这些差异性的LncRNA均具有开放阅读框(open reading frame,ORF),除了Lnc-SH3BP1和Lnc-RPL41以外,其余的LncRNA均具有内部核糖体结合位点(internal ribosome binding site,IRES)。结论 在DENV-3感染THP-1细胞及其介导的ADE感染中,LncRNA的表达发生了明显的差异性改变,且可能通过多种生物学功能调控感染的进程,有助于更深层次理解ADE感染的发生机制。

    2023年09期 v.36 1039-1046+1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1046K]
    [下载次数:107 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体的生物活性评价

    孙赫;王瑜;蔄弘扬;邱玥;田园;李泽鸿;岳玉环;

    目的 评价一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的生物活性。方法 采用Western blot法及局域表面等离子共振技术(localized surface plasmon resonance,LSPR)分别检测TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白的免疫结合活性及亲和力;CCK-8法检测TAT-ScFv-mFc对流感病毒H1N1的抑制作用;免疫荧光法检测TAT-ScFv-mFc对MDCK细胞的穿膜能力。雌性BALB/c小鼠尾静脉注射TAT-ScFv-mFc,200μL/只,共30只,于注射后5、60、120、240及360 min,断尾采血,分离血清,ELISA法检测血清效价,根据Origin 2021软件绘制的半衰期曲线计算半衰期。结果 TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白可发生特异性结合,结合数率常数(Ka)达6.67×10~4[1/(M*s)]。经H1N1感染的MDCK细胞的存活率随着TAT-ScFv-mFc浓度增加而逐渐升高,且呈剂量依赖性,对H1N1的复制有明显抑制作用。TAT-ScFv-mFc可在短时间内穿过MDCK细胞膜,进入细胞内,结合病毒M1蛋白,从而抑制病毒的复制和组装。TAT-ScFv-mFc在小鼠体内的半衰期为212 min。结论 TAT-ScFv-mFc具有与H5N1-M1良好的免疫结合活性及亲和力,可有效抑制H1N1的复制,对MDCK细胞膜有良好的穿透能力,且在小鼠体内半衰期较长,为H5N1感染的药物治疗、疫苗研究、预防治疗奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1047-1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1020K]
    [下载次数:50 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体的生物活性评价

    孙赫;王瑜;蔄弘扬;邱玥;田园;李泽鸿;岳玉环;

    目的 评价一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的生物活性。方法 采用Western blot法及局域表面等离子共振技术(localized surface plasmon resonance,LSPR)分别检测TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白的免疫结合活性及亲和力;CCK-8法检测TAT-ScFv-mFc对流感病毒H1N1的抑制作用;免疫荧光法检测TAT-ScFv-mFc对MDCK细胞的穿膜能力。雌性BALB/c小鼠尾静脉注射TAT-ScFv-mFc,200μL/只,共30只,于注射后5、60、120、240及360 min,断尾采血,分离血清,ELISA法检测血清效价,根据Origin 2021软件绘制的半衰期曲线计算半衰期。结果 TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白可发生特异性结合,结合数率常数(Ka)达6.67×10~4[1/(M*s)]。经H1N1感染的MDCK细胞的存活率随着TAT-ScFv-mFc浓度增加而逐渐升高,且呈剂量依赖性,对H1N1的复制有明显抑制作用。TAT-ScFv-mFc可在短时间内穿过MDCK细胞膜,进入细胞内,结合病毒M1蛋白,从而抑制病毒的复制和组装。TAT-ScFv-mFc在小鼠体内的半衰期为212 min。结论 TAT-ScFv-mFc具有与H5N1-M1良好的免疫结合活性及亲和力,可有效抑制H1N1的复制,对MDCK细胞膜有良好的穿透能力,且在小鼠体内半衰期较长,为H5N1感染的药物治疗、疫苗研究、预防治疗奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1047-1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1020K]
    [下载次数:50 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 重组人血清白蛋白在CHO细胞中的高效表达及其培养工艺优化

    牛宇辉;李洪珊;李殿玉;吴贝;李向茸;冯若飞;

    目的 在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高效表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),并优化其培养工艺,为HSA的规模化生产奠定基础。方法 利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体,并将其电转染至全悬浮CHO细胞中,利用G418及有限稀释法筛选获得可稳定高表达HSA的单克隆细胞株,通过在基础培养基中添加葡萄糖、丁酸钠及补料培养基等方式进行细胞培养工艺优化,以提高HSA表达量;最终在5 L生物反应器上进行放大培养验证。结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-HSA,并在全悬浮CHO细胞中实现分泌表达后,又经过2次单克隆筛选,获得高表达HSA的2次单克隆细胞株CHO-rHSA-7H2A9和CHO-rHSA-7H2D12,表达量分别达到29.37和25.26 mg/L;通过培养工艺优化使HSA表达量达到100.00 mg/L左右;最终使5 L生物反应器上HSA表达量提升至166.16 mg/L,与第1次单克隆细胞上清中HSA表达量相比,提高了30倍左右。结论 实现了HSA在CHO细胞中的高效表达,为进一步在生物制品领域规模化生产HSA及解决市场供应问题奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1054-1061+1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1069K]
    [下载次数:505 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 重组人血清白蛋白在CHO细胞中的高效表达及其培养工艺优化

    牛宇辉;李洪珊;李殿玉;吴贝;李向茸;冯若飞;

    目的 在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高效表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),并优化其培养工艺,为HSA的规模化生产奠定基础。方法 利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体,并将其电转染至全悬浮CHO细胞中,利用G418及有限稀释法筛选获得可稳定高表达HSA的单克隆细胞株,通过在基础培养基中添加葡萄糖、丁酸钠及补料培养基等方式进行细胞培养工艺优化,以提高HSA表达量;最终在5 L生物反应器上进行放大培养验证。结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-HSA,并在全悬浮CHO细胞中实现分泌表达后,又经过2次单克隆筛选,获得高表达HSA的2次单克隆细胞株CHO-rHSA-7H2A9和CHO-rHSA-7H2D12,表达量分别达到29.37和25.26 mg/L;通过培养工艺优化使HSA表达量达到100.00 mg/L左右;最终使5 L生物反应器上HSA表达量提升至166.16 mg/L,与第1次单克隆细胞上清中HSA表达量相比,提高了30倍左右。结论 实现了HSA在CHO细胞中的高效表达,为进一步在生物制品领域规模化生产HSA及解决市场供应问题奠定了基础。

    2023年09期 v.36 1054-1061+1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1069K]
    [下载次数:505 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • LRRC23激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响

    朱艳慧;杨芳芳;王鑫;邢雅玲;刘雅琳;

    目的 探讨LRRC23(leucine rich repeat containing 23)激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响。方法 通过在A549细胞中过表达和敲低LRRC23,探讨其对流感病毒复制的影响。将pcLRRC23质粒和siLRRC23(small interfering LRRC23)分别转染A549细胞,24 h后感染A/京防/1/86(H1N1),空斑试验和ELISA法分别检测细胞上清中流感病毒滴度和HA蛋白表达水平;qRT-PCR和Western blot法分别检测LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS、流感病毒M1基因及HA蛋白的表达水平;免疫荧光和免疫共沉淀试验(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测LRRC23与RIG-Ⅰ的相互作用;双荧光素酶报告基因分析试验检测IFN-β-luc和NF-κB-luc活性。结果 过表达LRRC23可显著降低流感病毒A549细胞上清中流感病毒滴度,抑制HA蛋白的表达。过表达LRRC23通过激活RIG-Ⅰ-MAVS信号通路,增强流感病毒刺激的IFN-β和NF-κB激活,抑制流感病毒M1基因和HA蛋白的表达。相反,敲低LRRC23可增加流感病毒感染A549细胞上清中HA蛋白的表达;上调流感病毒M1基因相对表达量,下调RIG-ⅠmRNA和MAVS mRNA相对表达量。结论 LRRC23通过激活RIG-Ⅰ信号通路抑制流感病毒复制,在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。

    2023年09期 v.36 1062-1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1031K]
    [下载次数:225 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • LRRC23激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响

    朱艳慧;杨芳芳;王鑫;邢雅玲;刘雅琳;

    目的 探讨LRRC23(leucine rich repeat containing 23)激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响。方法 通过在A549细胞中过表达和敲低LRRC23,探讨其对流感病毒复制的影响。将pcLRRC23质粒和siLRRC23(small interfering LRRC23)分别转染A549细胞,24 h后感染A/京防/1/86(H1N1),空斑试验和ELISA法分别检测细胞上清中流感病毒滴度和HA蛋白表达水平;qRT-PCR和Western blot法分别检测LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS、流感病毒M1基因及HA蛋白的表达水平;免疫荧光和免疫共沉淀试验(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测LRRC23与RIG-Ⅰ的相互作用;双荧光素酶报告基因分析试验检测IFN-β-luc和NF-κB-luc活性。结果 过表达LRRC23可显著降低流感病毒A549细胞上清中流感病毒滴度,抑制HA蛋白的表达。过表达LRRC23通过激活RIG-Ⅰ-MAVS信号通路,增强流感病毒刺激的IFN-β和NF-κB激活,抑制流感病毒M1基因和HA蛋白的表达。相反,敲低LRRC23可增加流感病毒感染A549细胞上清中HA蛋白的表达;上调流感病毒M1基因相对表达量,下调RIG-ⅠmRNA和MAVS mRNA相对表达量。结论 LRRC23通过激活RIG-Ⅰ信号通路抑制流感病毒复制,在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。

    2023年09期 v.36 1062-1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1031K]
    [下载次数:225 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 2018年云南省手足口病与疱疹性咽峡炎柯萨奇病毒A6型全基因组比较分析

    唐姣连;张晓琳;张志磊;南巍巍;薛丽;蒋海燕;张桢;孙强明;蒋鸿超;

    目的 分析2018年云南省17株引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)与疱疹性咽峡炎(herpangina,HA)的柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6,CVA6)全基因组特征,了解不同致病CVA6之间的基因差异。方法随机抽取昆明市儿童医院2018年临床诊断为HFMD与HA的1 909份粪便样本,使用肠道病毒A组通用引物进行检测并筛选CVA6阳性样本。用CVA6全基因组引物进行序列扩增,经BioEdit软件拼接后获得CVA6全基因序列,应用BioEdit、MEGA 7.0、Simplot、Heml 1.0及Phyre2等软件分析CVA6全基因组特征。结果 筛选出CVA6阳性样本929份,获得CVA6全基因序列17株(其中9株临床诊断为HFMD,8株临床诊断为HA);17株CVA6在全基因系统进化树上均处于Ⅳ型分支;HA、HFMD代表株未发生明显重组,但在非结构蛋白3D区发生变异;HFMD、HA代表株在VP1的S597T、Q705L和Q663L位点存在差异,在线预测分析发现其VP1二级结构与CVA6原型株一致,未发生改变。结论引起HFMD与HA的17株CVA6之间具有较高的基因组同源性,同时也存在核苷酸及氨基酸差异,这种变化可能对CVA6的复制及适应性产生影响。

    2023年09期 v.36 1072-1079页 [查看摘要][在线阅读][下载 1400K]
    [下载次数:136 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • 2018年云南省手足口病与疱疹性咽峡炎柯萨奇病毒A6型全基因组比较分析

    唐姣连;张晓琳;张志磊;南巍巍;薛丽;蒋海燕;张桢;孙强明;蒋鸿超;

    目的 分析2018年云南省17株引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)与疱疹性咽峡炎(herpangina,HA)的柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6,CVA6)全基因组特征,了解不同致病CVA6之间的基因差异。方法随机抽取昆明市儿童医院2018年临床诊断为HFMD与HA的1 909份粪便样本,使用肠道病毒A组通用引物进行检测并筛选CVA6阳性样本。用CVA6全基因组引物进行序列扩增,经BioEdit软件拼接后获得CVA6全基因序列,应用BioEdit、MEGA 7.0、Simplot、Heml 1.0及Phyre2等软件分析CVA6全基因组特征。结果 筛选出CVA6阳性样本929份,获得CVA6全基因序列17株(其中9株临床诊断为HFMD,8株临床诊断为HA);17株CVA6在全基因系统进化树上均处于Ⅳ型分支;HA、HFMD代表株未发生明显重组,但在非结构蛋白3D区发生变异;HFMD、HA代表株在VP1的S597T、Q705L和Q663L位点存在差异,在线预测分析发现其VP1二级结构与CVA6原型株一致,未发生改变。结论引起HFMD与HA的17株CVA6之间具有较高的基因组同源性,同时也存在核苷酸及氨基酸差异,这种变化可能对CVA6的复制及适应性产生影响。

    2023年09期 v.36 1072-1079页 [查看摘要][在线阅读][下载 1400K]
    [下载次数:136 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • ELP_(30)-intein标签在重组脂蛋白相关磷脂酶A_2原核表达中的作用

    阮瑶;丁宁;于军;

    目的 探讨ELP_(30)-intein标签在重组脂蛋白相关磷脂酶A_2(lipoprotein-associated phospholipase A_2,LP-PL A_2)原核表达过程中的作用。方法 将重组质粒pIG6-ELP_(30)-intein-LP-PL A_2转化至感受态E.coli W3110中,以不携带ELP_(30)-intein标签的重组质粒pIG6-LP-PL A_2为阴性对照,对不同温度(20、25、30℃)及诱导方式(IPTG及自动诱导)下重组ELP_(30)-intein-LP-PL A_2的质周腔表达情况进行Western blot分析。采用基于类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)标签的可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)技术纯化并分离目的蛋白,进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 不携带ELP_(30)-intein标签的LP-PL A_2重组蛋白仅于胞内表达,无法定位于质周腔。在相同诱导温度条件下,自动培养基诱导表达获得的目标蛋白量远低于IPTG诱导表达。与20℃比较,IPTG诱导温度为25及30℃时,目标蛋白总体表达水平有所提升。采用ITC技术成功分离纯化目标蛋白ELP_(30)-intein-LP-PL A_2,通过诱导内含肽自身剪切获得了LP-PL A_2重组蛋白,纯度为70%,且可与抗LP-PL A_2抗体发生特异性结合。结论 ELP_(30)-intein标签可促进重组蛋白LP-PLA_2在E.coli质周腔内的表达,且通过非色谱纯化技术分离获得的LP-PL A_2重组蛋白纯度为70%,为快速、低成本有效生产LP-PL A_2重组蛋白提供了新方法。

    2023年09期 v.36 1080-1084+1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 832K]
    [下载次数:74 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • ELP_(30)-intein标签在重组脂蛋白相关磷脂酶A_2原核表达中的作用

    阮瑶;丁宁;于军;

    目的 探讨ELP_(30)-intein标签在重组脂蛋白相关磷脂酶A_2(lipoprotein-associated phospholipase A_2,LP-PL A_2)原核表达过程中的作用。方法 将重组质粒pIG6-ELP_(30)-intein-LP-PL A_2转化至感受态E.coli W3110中,以不携带ELP_(30)-intein标签的重组质粒pIG6-LP-PL A_2为阴性对照,对不同温度(20、25、30℃)及诱导方式(IPTG及自动诱导)下重组ELP_(30)-intein-LP-PL A_2的质周腔表达情况进行Western blot分析。采用基于类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)标签的可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)技术纯化并分离目的蛋白,进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 不携带ELP_(30)-intein标签的LP-PL A_2重组蛋白仅于胞内表达,无法定位于质周腔。在相同诱导温度条件下,自动培养基诱导表达获得的目标蛋白量远低于IPTG诱导表达。与20℃比较,IPTG诱导温度为25及30℃时,目标蛋白总体表达水平有所提升。采用ITC技术成功分离纯化目标蛋白ELP_(30)-intein-LP-PL A_2,通过诱导内含肽自身剪切获得了LP-PL A_2重组蛋白,纯度为70%,且可与抗LP-PL A_2抗体发生特异性结合。结论 ELP_(30)-intein标签可促进重组蛋白LP-PLA_2在E.coli质周腔内的表达,且通过非色谱纯化技术分离获得的LP-PL A_2重组蛋白纯度为70%,为快速、低成本有效生产LP-PL A_2重组蛋白提供了新方法。

    2023年09期 v.36 1080-1084+1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 832K]
    [下载次数:74 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]

诊断制剂

  • 抗SARS-CoV-2 IgG抗体第2代内控参考品的制备及其在ELISA检测方法中适用性的评价

    周志军;彭焱;岳胜兰;陈丽梅;罗娟;冯璐;纪德铭;李璞;邓琨;李策生;李陶敬;胡勇;

    目的 制备抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-Co V-2)IgG抗体第2代内控参考品(B2),并评价其在ELISA检测方法中的适用性。方法 在接种北京生物制品研究所有限责任公司生产的SARS-Co V-2灭活疫苗(BBIBP-Cor V)志愿者中,初筛19份ELISA-IgG稀释倍数在20~60之间IgG抗体阳性的血浆,再采用ELISA法检测初筛血浆的IgG抗体、Ig M抗体及中和抗体,选取ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率相近的非脂血血浆制备B2。用抗SARS-Co V-2免疫球蛋白第1代WHO国际标准品(NIBSC 20/136)标定第1代内控参考品(B1)、B2经ELISA法检测的中和抗体效价,并验证B2的加速稳定性(2~8℃分别放置5、8、14、20、30 d)、使用稳定性(18~25℃分别放置1、2、3 h)、冻融稳定性(1、2、3次)及长期稳定性(-25℃放置10个月)。以B2为标准品检测单份疫苗免疫后血浆,按照不同ELISA-IgG稀释倍数档位进行合并,制备不同档位的混合血浆,对混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价进行相关性及线性回归分析。结果19份血浆中,ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率接近的非脂血血浆共5份,每份血浆按等体积分数混合制备B2,其ELISA-IgG稀释倍数赋值为32。NIBSC 20/136标定的B1中和抗体效价为133.38 EIU/m L B2为122.14 EIU/m L。B2的加速稳定性、使用稳定性、冻融稳定性及长期稳定性回收率均在(100±15)%范围内。相同来源的混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价均呈显著相关(R~2均> 0.99,P均<0.000 1)。结论以SARS-Co V-2灭活疫苗免疫后血浆为原料制备的B2可替代用COVID-19康复者恢复期血浆为原料制备的B1。

    2023年09期 v.36 1085-1092页 [查看摘要][在线阅读][下载 872K]
    [下载次数:70 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • 抗SARS-CoV-2 IgG抗体第2代内控参考品的制备及其在ELISA检测方法中适用性的评价

    周志军;彭焱;岳胜兰;陈丽梅;罗娟;冯璐;纪德铭;李璞;邓琨;李策生;李陶敬;胡勇;

    目的 制备抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-Co V-2)IgG抗体第2代内控参考品(B2),并评价其在ELISA检测方法中的适用性。方法 在接种北京生物制品研究所有限责任公司生产的SARS-Co V-2灭活疫苗(BBIBP-Cor V)志愿者中,初筛19份ELISA-IgG稀释倍数在20~60之间IgG抗体阳性的血浆,再采用ELISA法检测初筛血浆的IgG抗体、Ig M抗体及中和抗体,选取ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率相近的非脂血血浆制备B2。用抗SARS-Co V-2免疫球蛋白第1代WHO国际标准品(NIBSC 20/136)标定第1代内控参考品(B1)、B2经ELISA法检测的中和抗体效价,并验证B2的加速稳定性(2~8℃分别放置5、8、14、20、30 d)、使用稳定性(18~25℃分别放置1、2、3 h)、冻融稳定性(1、2、3次)及长期稳定性(-25℃放置10个月)。以B2为标准品检测单份疫苗免疫后血浆,按照不同ELISA-IgG稀释倍数档位进行合并,制备不同档位的混合血浆,对混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价进行相关性及线性回归分析。结果19份血浆中,ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率接近的非脂血血浆共5份,每份血浆按等体积分数混合制备B2,其ELISA-IgG稀释倍数赋值为32。NIBSC 20/136标定的B1中和抗体效价为133.38 EIU/m L B2为122.14 EIU/m L。B2的加速稳定性、使用稳定性、冻融稳定性及长期稳定性回收率均在(100±15)%范围内。相同来源的混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价均呈显著相关(R~2均> 0.99,P均<0.000 1)。结论以SARS-Co V-2灭活疫苗免疫后血浆为原料制备的B2可替代用COVID-19康复者恢复期血浆为原料制备的B1。

    2023年09期 v.36 1085-1092页 [查看摘要][在线阅读][下载 872K]
    [下载次数:70 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]

治疗制剂

  • 冻存对复溶后人粒细胞刺激因子国家标准品生物学活性的影响

    朱留强;史新昌;刘兰;裴德宁;于雷;秦玺;周勇;王军志;

    目的 探讨冻存对复溶后人粒细胞刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factor,hG-CSF)国家标准品生物学活性的影响,为hG-CSF国家标准品的使用提供参考。方法 依据《中国药典》三部(2020版)通则3525测定标准品的生物学活性;将复溶后的hG-CSF国家标准品分装后置于-80、-40、-20℃保存,分别于第1、2、3、5和6个月取样检测生物学活性,用临用前复溶的标准品定量-80℃存放不同时间的标准品,以-80℃存放的样品为100%活性对照品定量其余样品的相对生物学活性。结果 热加速稳定试验拟合Eyrlng方程为:ln{k(t)}=6.75-3 772.20/T+ln(T),R2=0.969,预测hG-CSF国家标准品于-80℃贮存时,生物学活性衰减5%约需93.4个月;-80℃冻存的复溶标准品生物学活性值下降约24%。结论 hG-CSF国家标准品复溶分装后于-80℃可稳定保存半年以上。但冻融会引起活性值下降超过20%,因此不建议复溶后分装储存使用。

    2023年09期 v.36 1093-1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 782K]
    [下载次数:58 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 冻存对复溶后人粒细胞刺激因子国家标准品生物学活性的影响

    朱留强;史新昌;刘兰;裴德宁;于雷;秦玺;周勇;王军志;

    目的 探讨冻存对复溶后人粒细胞刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factor,hG-CSF)国家标准品生物学活性的影响,为hG-CSF国家标准品的使用提供参考。方法 依据《中国药典》三部(2020版)通则3525测定标准品的生物学活性;将复溶后的hG-CSF国家标准品分装后置于-80、-40、-20℃保存,分别于第1、2、3、5和6个月取样检测生物学活性,用临用前复溶的标准品定量-80℃存放不同时间的标准品,以-80℃存放的样品为100%活性对照品定量其余样品的相对生物学活性。结果 热加速稳定试验拟合Eyrlng方程为:ln{k(t)}=6.75-3 772.20/T+ln(T),R2=0.969,预测hG-CSF国家标准品于-80℃贮存时,生物学活性衰减5%约需93.4个月;-80℃冻存的复溶标准品生物学活性值下降约24%。结论 hG-CSF国家标准品复溶分装后于-80℃可稳定保存半年以上。但冻融会引起活性值下降超过20%,因此不建议复溶后分装储存使用。

    2023年09期 v.36 1093-1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 782K]
    [下载次数:58 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]

临床研究

  • PLCH1基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移的影响

    卞琳;高迎真;申柳依;张玲;

    目的 检测PLCH1基因在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的变异及表达情况,分析PLCH1在食管癌中的功能,并初步探讨其作用机制。方法 利用GISTIC分析PLCH1在ESCC中的拷贝数变异情况,TCGA数据库及免疫组织化学法检测PLCH1在ESCC与正常食管组织中的表达情况。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ESCC细胞系中PLCH1的表达情况。采用MTT、克隆形成试验、Transwell法等检测PLCH1沉默对ESCC细胞增殖及迁移能力的影响。结果 PLCH1在ESCC中存在显著的拷贝数扩增(G-scores> 0.1,P <0.05),ESCC中PLCH1 mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常组织(F=36.00~1 101.00,P均<0.000 1)。PLCH1沉默后,ESCC细胞KYESE180和TE-9的增殖能力、克隆形成能力及迁移能力均显著降低(F=35.49~634.00,P均<0.001)。结论 PLCH1在ESCC中发挥癌基因作用,对ESCC的转移和增殖具有重要意义,可作为ESCC治疗的潜在靶点。

    2023年09期 v.36 1097-1104页 [查看摘要][在线阅读][下载 1272K]
    [下载次数:69 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • PLCH1基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移的影响

    卞琳;高迎真;申柳依;张玲;

    目的 检测PLCH1基因在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的变异及表达情况,分析PLCH1在食管癌中的功能,并初步探讨其作用机制。方法 利用GISTIC分析PLCH1在ESCC中的拷贝数变异情况,TCGA数据库及免疫组织化学法检测PLCH1在ESCC与正常食管组织中的表达情况。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ESCC细胞系中PLCH1的表达情况。采用MTT、克隆形成试验、Transwell法等检测PLCH1沉默对ESCC细胞增殖及迁移能力的影响。结果 PLCH1在ESCC中存在显著的拷贝数扩增(G-scores> 0.1,P <0.05),ESCC中PLCH1 mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常组织(F=36.00~1 101.00,P均<0.000 1)。PLCH1沉默后,ESCC细胞KYESE180和TE-9的增殖能力、克隆形成能力及迁移能力均显著降低(F=35.49~634.00,P均<0.001)。结论 PLCH1在ESCC中发挥癌基因作用,对ESCC的转移和增殖具有重要意义,可作为ESCC治疗的潜在靶点。

    2023年09期 v.36 1097-1104页 [查看摘要][在线阅读][下载 1272K]
    [下载次数:69 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)在≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群中的安全性及免疫原性评价

    陈仙红;张锐智;穆秋玥;冯军;魏绍峰;雷世光;

    目的 评价≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)后的安全性和免疫原性。方法 于贵州省松桃苗族自治县选择≥60岁高血压、糖尿病患者及健康人群为研究对象,分为高血压组、糖尿病组、合并疾病组(同时患高血压与糖尿病)、健康人群对照组,分别于0、21 d经上臂外侧三角肌肌内注射SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞),接种剂量为0.5 mL。记录免疫后≤30 min、0~7 d、8~21 d时间段的不良事件,并随访至接种后6个月。分别于疫苗接种前及接种后28 d,采集受试者静脉血5.0 mL,分离血清,采用细胞病变法检测中和抗体水平,并计算中和抗体几何平均滴度(geometric mean titers,GMT)及抗体阳转率。高血压组及疾病合并组患者分别于每剂接种前、接种后30 min及1~7 d固定时间测量血压;糖尿病组及疾病合并组患者分别于每剂接种前测量1次空腹血糖,接种后当天测量1次餐后2 h血糖,接种后1、3、5、7 d分别检测空腹和餐后2 h血糖。结果 高血压组、糖尿病组、合并疾病组、健康人群对照组征集性不良事件发生率差异无统计学意义(χ2=1.790,P=0.617);非征集性不良事件的发生率差异无统计学意义(P=0.412)。共发生5例严重不良事件,经判定均与疫苗无关。血压和血糖测定值未见异常波动。高血压组、糖尿病组和合并疾病组率差的95%CI的下限均>-10%,中和抗体GMT率比的95%CI下限均> 0.67,均非劣效于健康人群对照组。结论 ≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群接种SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)后具有良好的安全性和免疫原性。

    2023年09期 v.36 1105-1110+1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 920K]
    [下载次数:92 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)在≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群中的安全性及免疫原性评价

    陈仙红;张锐智;穆秋玥;冯军;魏绍峰;雷世光;

    目的 评价≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)后的安全性和免疫原性。方法 于贵州省松桃苗族自治县选择≥60岁高血压、糖尿病患者及健康人群为研究对象,分为高血压组、糖尿病组、合并疾病组(同时患高血压与糖尿病)、健康人群对照组,分别于0、21 d经上臂外侧三角肌肌内注射SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞),接种剂量为0.5 mL。记录免疫后≤30 min、0~7 d、8~21 d时间段的不良事件,并随访至接种后6个月。分别于疫苗接种前及接种后28 d,采集受试者静脉血5.0 mL,分离血清,采用细胞病变法检测中和抗体水平,并计算中和抗体几何平均滴度(geometric mean titers,GMT)及抗体阳转率。高血压组及疾病合并组患者分别于每剂接种前、接种后30 min及1~7 d固定时间测量血压;糖尿病组及疾病合并组患者分别于每剂接种前测量1次空腹血糖,接种后当天测量1次餐后2 h血糖,接种后1、3、5、7 d分别检测空腹和餐后2 h血糖。结果 高血压组、糖尿病组、合并疾病组、健康人群对照组征集性不良事件发生率差异无统计学意义(χ2=1.790,P=0.617);非征集性不良事件的发生率差异无统计学意义(P=0.412)。共发生5例严重不良事件,经判定均与疫苗无关。血压和血糖测定值未见异常波动。高血压组、糖尿病组和合并疾病组率差的95%CI的下限均>-10%,中和抗体GMT率比的95%CI下限均> 0.67,均非劣效于健康人群对照组。结论 ≥60岁高血压和(/或)糖尿病人群接种SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)后具有良好的安全性和免疫原性。

    2023年09期 v.36 1105-1110+1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 920K]
    [下载次数:92 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • 2009—2022年吉林省麻疹流行规律分析

    单元春;王爽;吴东林;田鑫;程涛;付思美;郭淑英;杨显达;

    目的 分析2009—2022年吉林省麻疹流行规律,为制定麻疹防控措施提供依据。方法 采用描述流行病学方法对2009—2022年吉林省麻疹确诊病例的发病率、免疫史及年龄组分布情况进行分析。并对麻疹代表株进行测序,采用生物信息学软件Bioedit和Mega 11分析优势流行株及其变异情况。结果 2009—2022年吉林省共报告麻疹病例6 560例,其中含麻疹成分疫苗免疫史为0剂次及免疫史不详病例分别占50.17%和27.58%。0~24月龄组占总病例数的47.29%,≥15岁组占总病例数的37.41%。报告发病率受免疫策略和新型冠状病毒疫情影响,近3年内达到<1/100万的消除水平。吉林省麻疹病毒优势基因型仍为H1a基因亚型,分子流行病学分析显示有2条大型传播链持续共同流行,其中1条传播链于2015年被阻断。结论 2009—2022年吉林省麻疹报告发病率呈下降趋势,病例年龄呈双向位移分布,集中于无免疫史和免疫史不详人群。应继续提高基础接种率,有针对性地开展强化免疫,加强分子流行病学监测,及时阻断传播链。

    2023年09期 v.36 1111-1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 1280K]
    [下载次数:97 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 2009—2022年吉林省麻疹流行规律分析

    单元春;王爽;吴东林;田鑫;程涛;付思美;郭淑英;杨显达;

    目的 分析2009—2022年吉林省麻疹流行规律,为制定麻疹防控措施提供依据。方法 采用描述流行病学方法对2009—2022年吉林省麻疹确诊病例的发病率、免疫史及年龄组分布情况进行分析。并对麻疹代表株进行测序,采用生物信息学软件Bioedit和Mega 11分析优势流行株及其变异情况。结果 2009—2022年吉林省共报告麻疹病例6 560例,其中含麻疹成分疫苗免疫史为0剂次及免疫史不详病例分别占50.17%和27.58%。0~24月龄组占总病例数的47.29%,≥15岁组占总病例数的37.41%。报告发病率受免疫策略和新型冠状病毒疫情影响,近3年内达到<1/100万的消除水平。吉林省麻疹病毒优势基因型仍为H1a基因亚型,分子流行病学分析显示有2条大型传播链持续共同流行,其中1条传播链于2015年被阻断。结论 2009—2022年吉林省麻疹报告发病率呈下降趋势,病例年龄呈双向位移分布,集中于无免疫史和免疫史不详人群。应继续提高基础接种率,有针对性地开展强化免疫,加强分子流行病学监测,及时阻断传播链。

    2023年09期 v.36 1111-1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 1280K]
    [下载次数:97 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 新疆维吾尔自治区动物莱姆病的流行病学调查

    叶锋;杜秋丽;刘丽娅;马晓菁;谢彩云;谷文喜;马俊杰;易新萍;

    目的 对新疆维吾尔自治区(简称新疆)4个地区5种蜱虫宿主动物进行莱姆病流行病学调查,并分析伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的流行基因型。方法 取于新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉及喀什4个地区采集的牛、绵羊、山羊、马和犬血清样本共814份,采用ELISA法测定血清中莱姆病IgG抗体。于上述地区收集蜱虫135只,提取DNA,以其为模板,经巢式PCR法扩增伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA间隔区片段,取阳性样本进行测序。测序结果与GenBank中已登录的伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列进行BLAST比对,并应用MEGA X软件构建系统进化树。结果 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁、昌吉地区血清样本莱姆病IgG抗体阳性率分别为23.6%、2.4%、2.7%和0,4个地区差异有统计学意义(χ2=48.481,P <0.001);牛、绵羊、山羊、犬和马血清样本的莱姆病IgG抗体阳性率分别为1.1%、4.4%、18.7%、60.5%和0,5种动物差异有统计学意义(χ2=129.03,P <0.001)。135份蜱虫DNA样本中有24份为伯氏疏螺旋体阳性,带菌率约17.78%,包括B.garinii(占比75%)、B.afzelii(占比16.67%)、B.burgdorferi(占比8.33%)3种基因型。结论 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁3个地区的牛、绵羊、山羊和犬4种动物存在莱姆病感染,以B.garinii为主要流行基因型。本研究为新疆地区莱姆病的防控提供了参考。

    2023年09期 v.36 1117-1120页 [查看摘要][在线阅读][下载 862K]
    [下载次数:200 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:0 ]
  • 新疆维吾尔自治区动物莱姆病的流行病学调查

    叶锋;杜秋丽;刘丽娅;马晓菁;谢彩云;谷文喜;马俊杰;易新萍;

    目的 对新疆维吾尔自治区(简称新疆)4个地区5种蜱虫宿主动物进行莱姆病流行病学调查,并分析伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的流行基因型。方法 取于新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉及喀什4个地区采集的牛、绵羊、山羊、马和犬血清样本共814份,采用ELISA法测定血清中莱姆病IgG抗体。于上述地区收集蜱虫135只,提取DNA,以其为模板,经巢式PCR法扩增伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA间隔区片段,取阳性样本进行测序。测序结果与GenBank中已登录的伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列进行BLAST比对,并应用MEGA X软件构建系统进化树。结果 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁、昌吉地区血清样本莱姆病IgG抗体阳性率分别为23.6%、2.4%、2.7%和0,4个地区差异有统计学意义(χ2=48.481,P <0.001);牛、绵羊、山羊、犬和马血清样本的莱姆病IgG抗体阳性率分别为1.1%、4.4%、18.7%、60.5%和0,5种动物差异有统计学意义(χ2=129.03,P <0.001)。135份蜱虫DNA样本中有24份为伯氏疏螺旋体阳性,带菌率约17.78%,包括B.garinii(占比75%)、B.afzelii(占比16.67%)、B.burgdorferi(占比8.33%)3种基因型。结论 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁3个地区的牛、绵羊、山羊和犬4种动物存在莱姆病感染,以B.garinii为主要流行基因型。本研究为新疆地区莱姆病的防控提供了参考。

    2023年09期 v.36 1117-1120页 [查看摘要][在线阅读][下载 862K]
    [下载次数:200 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:0 ]

技术方法

  • 分型鉴别HPIV1、HPIV2及HPIV3多重荧光定量RT-PCR方法的建立及验证

    程子恩;刘芷宁;曹鹏程;赵亚齐;侯广争;刘琪琦;刘馨;

    目的 建立可同时鉴别人副流感病毒1型(human parainfluenza virus type 1,HPIV1)、2型(HPIV2)、3型(HPIV3)的多重荧光定量RT-PCR方法,并进行验证。方法 通过数据库下载HPIV1、HPIV2和HPIV3全基因组序列进行比对分析,选择保守区域,针对这3种病毒分别设计特异性引物及探针,以人核糖核酸酶P(RNase P)为内质控,建立多重荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和精密度进行验证。采用建立的方法对192份临床样本进行检测。结果 经优化后,确定多重荧光定量RT-PCR反应体系为30μL,其中10×NeoscriptRTase/UNG Multi mix 3μL,5×Neoscript RT Premix Multi Buffer 6μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3(100μmol/L)上下游引物各0.1μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3探针(100μmol/L)各0.05μL,RNase P上下游引物(50μmol/L)各0.06μL,RNase P探针(50μmol/L)各0.03μL,模板15μL,ddH2O补至30μL。反应条件:50℃20 min,95℃3 min;95℃15 s,54℃30 s,共45个循环,每个循环退火时收集荧光信号。建立的多重荧光定量RT-PCR方法对HPIV1、HPIV2和HPIV3的最低检测限均达到500 copies/mL;与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒无交叉反应;3种不同浓度的重组质粒标准品混合物组内和组间变异系数(CV)均小于3%。192份临床样本中,HPIV1、HPIV2和HPIV3均检测出,阳性率分别为7.81%、0.05%和3.1%。结论 本研究建立的HPIV1、HPIV2和HPIV3多重荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和精密度,在HPIV的快速诊断和鉴别领域具有较高的临床应用前景。

    2023年09期 v.36 1121-1126页 [查看摘要][在线阅读][下载 835K]
    [下载次数:240 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • 分型鉴别HPIV1、HPIV2及HPIV3多重荧光定量RT-PCR方法的建立及验证

    程子恩;刘芷宁;曹鹏程;赵亚齐;侯广争;刘琪琦;刘馨;

    目的 建立可同时鉴别人副流感病毒1型(human parainfluenza virus type 1,HPIV1)、2型(HPIV2)、3型(HPIV3)的多重荧光定量RT-PCR方法,并进行验证。方法 通过数据库下载HPIV1、HPIV2和HPIV3全基因组序列进行比对分析,选择保守区域,针对这3种病毒分别设计特异性引物及探针,以人核糖核酸酶P(RNase P)为内质控,建立多重荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和精密度进行验证。采用建立的方法对192份临床样本进行检测。结果 经优化后,确定多重荧光定量RT-PCR反应体系为30μL,其中10×NeoscriptRTase/UNG Multi mix 3μL,5×Neoscript RT Premix Multi Buffer 6μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3(100μmol/L)上下游引物各0.1μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3探针(100μmol/L)各0.05μL,RNase P上下游引物(50μmol/L)各0.06μL,RNase P探针(50μmol/L)各0.03μL,模板15μL,ddH2O补至30μL。反应条件:50℃20 min,95℃3 min;95℃15 s,54℃30 s,共45个循环,每个循环退火时收集荧光信号。建立的多重荧光定量RT-PCR方法对HPIV1、HPIV2和HPIV3的最低检测限均达到500 copies/mL;与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒无交叉反应;3种不同浓度的重组质粒标准品混合物组内和组间变异系数(CV)均小于3%。192份临床样本中,HPIV1、HPIV2和HPIV3均检测出,阳性率分别为7.81%、0.05%和3.1%。结论 本研究建立的HPIV1、HPIV2和HPIV3多重荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和精密度,在HPIV的快速诊断和鉴别领域具有较高的临床应用前景。

    2023年09期 v.36 1121-1126页 [查看摘要][在线阅读][下载 835K]
    [下载次数:240 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:0 ]
  • 戊型肝炎疫苗效力国家参考品的制备

    高帆;卞莲莲;毛群颖;梁争论;吴星;

    目的 制备戊型肝炎疫苗(简称戊肝疫苗)效力国家参考品,用于戊肝疫苗效力的质量控制。方法 选取1批戊肝疫苗为候选参考品原料,加入经筛选的冻干保护剂,分装、冻干后制备为候选参考品,进行均匀性和稳定性考察,并分发给4个实验室进行协作标定和适用性研究。结果 选择5%海藻糖+2%右旋糖酐作为冻干保护剂制备候选参考品。候选参考品的分装精度为0.7%;抗原含量均匀性变异系数(coefficient of variation,CV)为9.0%;铝含量均匀性CV为4.0%。水分含量为1.7%。候选参考品具有较好的加速稳定性和复溶稳定性。协作标定共获得18个有效数据,结果显示候选参考品半数有效量(median effective dose,ED50)均值为0.15μg(95%置信区间为0.12~0.18μg),实验室内CV为30.8%~64.2%,实验室间CV为32.6%。2家实验室自行研制的戊肝疫苗与候选参考品均表现出良好的剂量效应关系,阳转率均随疫苗抗原含量减少而降低,曲线变化趋势相近。结论 首次制备了戊肝疫苗效力国家参考品(300031-201801),用于戊肝疫苗效力ED50检测质量控制。

    2023年09期 v.36 1127-1131+1137页 [查看摘要][在线阅读][下载 841K]
    [下载次数:126 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 戊型肝炎疫苗效力国家参考品的制备

    高帆;卞莲莲;毛群颖;梁争论;吴星;

    目的 制备戊型肝炎疫苗(简称戊肝疫苗)效力国家参考品,用于戊肝疫苗效力的质量控制。方法 选取1批戊肝疫苗为候选参考品原料,加入经筛选的冻干保护剂,分装、冻干后制备为候选参考品,进行均匀性和稳定性考察,并分发给4个实验室进行协作标定和适用性研究。结果 选择5%海藻糖+2%右旋糖酐作为冻干保护剂制备候选参考品。候选参考品的分装精度为0.7%;抗原含量均匀性变异系数(coefficient of variation,CV)为9.0%;铝含量均匀性CV为4.0%。水分含量为1.7%。候选参考品具有较好的加速稳定性和复溶稳定性。协作标定共获得18个有效数据,结果显示候选参考品半数有效量(median effective dose,ED50)均值为0.15μg(95%置信区间为0.12~0.18μg),实验室内CV为30.8%~64.2%,实验室间CV为32.6%。2家实验室自行研制的戊肝疫苗与候选参考品均表现出良好的剂量效应关系,阳转率均随疫苗抗原含量减少而降低,曲线变化趋势相近。结论 首次制备了戊肝疫苗效力国家参考品(300031-201801),用于戊肝疫苗效力ED50检测质量控制。

    2023年09期 v.36 1127-1131+1137页 [查看摘要][在线阅读][下载 841K]
    [下载次数:126 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]

综述

  • 噬菌体展示疫苗的研究进展

    王财;赵子红;李唯峰;张玉妥;

    噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒,因其固有的免疫原性、遗传可塑性、稳定性及安全性等优势,使其在疫苗研发中具有独特的潜力。目前,有较多利用其构建疫苗递送平台的研究,主要包括噬菌体展示疫苗、噬菌体DNA疫苗及杂交噬菌体DNA疫苗3种形式,其中研究最为广泛的是噬菌体展示疫苗。噬菌体展示技术是一种新型疫苗制备技术,是以噬菌体为载体,通过将外源多肽或蛋白基因整合至噬菌体基因中,以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的分子生物学技术。本文主要就噬菌体展示疫苗的免疫学基础、展示系统及其在疾病预防应用的研究进展作一综述,以期为噬菌体展示疫苗的研发与应用提供参考。

    2023年09期 v.36 1132-1137页 [查看摘要][在线阅读][下载 827K]
    [下载次数:364 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 噬菌体展示疫苗的研究进展

    王财;赵子红;李唯峰;张玉妥;

    噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒,因其固有的免疫原性、遗传可塑性、稳定性及安全性等优势,使其在疫苗研发中具有独特的潜力。目前,有较多利用其构建疫苗递送平台的研究,主要包括噬菌体展示疫苗、噬菌体DNA疫苗及杂交噬菌体DNA疫苗3种形式,其中研究最为广泛的是噬菌体展示疫苗。噬菌体展示技术是一种新型疫苗制备技术,是以噬菌体为载体,通过将外源多肽或蛋白基因整合至噬菌体基因中,以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的分子生物学技术。本文主要就噬菌体展示疫苗的免疫学基础、展示系统及其在疾病预防应用的研究进展作一综述,以期为噬菌体展示疫苗的研发与应用提供参考。

    2023年09期 v.36 1132-1137页 [查看摘要][在线阅读][下载 827K]
    [下载次数:364 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及挑战

    陶薇;傅婷;洪艳;

    艰难梭菌(Clostridiodes difficile,C.difficile)是全球最常见引起抗生素相关腹泻(antibiotic-associated diarrhea,ADD)的病因。近年来,随着具有高抗药性和高毒力菌株的出现,造成多次艰难梭菌感染全球流行。艰难梭菌感染发病率、复发率和死亡率在全球范围内呈上升趋势,为临床治疗带来极大挑战。致病性菌株主要产生两种同源性糖基化毒素A和B,会造成从腹泻到高致死的中毒型巨结肠等症状。鉴于艰难梭菌感染造成的恶性后果,疾病的预防仍然是值得探索的重要途径。目前尚无获得使用许可的艰难梭菌疫苗,因此本文对艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及面临的挑战作一综述。

    2023年09期 v.36 1138-1142页 [查看摘要][在线阅读][下载 799K]
    [下载次数:90 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及挑战

    陶薇;傅婷;洪艳;

    艰难梭菌(Clostridiodes difficile,C.difficile)是全球最常见引起抗生素相关腹泻(antibiotic-associated diarrhea,ADD)的病因。近年来,随着具有高抗药性和高毒力菌株的出现,造成多次艰难梭菌感染全球流行。艰难梭菌感染发病率、复发率和死亡率在全球范围内呈上升趋势,为临床治疗带来极大挑战。致病性菌株主要产生两种同源性糖基化毒素A和B,会造成从腹泻到高致死的中毒型巨结肠等症状。鉴于艰难梭菌感染造成的恶性后果,疾病的预防仍然是值得探索的重要途径。目前尚无获得使用许可的艰难梭菌疫苗,因此本文对艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及面临的挑战作一综述。

    2023年09期 v.36 1138-1142页 [查看摘要][在线阅读][下载 799K]
    [下载次数:90 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 囊泡相关膜蛋白8的研究进展

    张鑫;侯雪阳;张瑞;唐景峰;

    膜融合对真核生物的诸多生命活动至关重要,需要不同的囊泡转运蛋白互相配合,从而特异性协调并辅助不同生物膜的融合,这些囊泡转运蛋白高度保守。囊泡相关膜蛋白8(vesicle associated membrane protein 8,VAMP8)主要定位于囊泡膜和溶酶体膜,其在多种不同生物膜的融合中发挥重要作用。本文就VAMP8的分子结构、转录调控和翻译后修饰、生物学功能及其与人类疾病相关性的研究进展作一综述,以期为治疗相关疾病和开发有效的VAMP8靶点药物提供新思路。

    2023年09期 v.36 1143-1148页 [查看摘要][在线阅读][下载 853K]
    [下载次数:200 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 囊泡相关膜蛋白8的研究进展

    张鑫;侯雪阳;张瑞;唐景峰;

    膜融合对真核生物的诸多生命活动至关重要,需要不同的囊泡转运蛋白互相配合,从而特异性协调并辅助不同生物膜的融合,这些囊泡转运蛋白高度保守。囊泡相关膜蛋白8(vesicle associated membrane protein 8,VAMP8)主要定位于囊泡膜和溶酶体膜,其在多种不同生物膜的融合中发挥重要作用。本文就VAMP8的分子结构、转录调控和翻译后修饰、生物学功能及其与人类疾病相关性的研究进展作一综述,以期为治疗相关疾病和开发有效的VAMP8靶点药物提供新思路。

    2023年09期 v.36 1143-1148页 [查看摘要][在线阅读][下载 853K]
    [下载次数:200 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • SARS-CoV-2疫苗不同动物模型攻毒试验常见问题及考虑

    吴爽;王寅;孙涛;

    动物攻毒试验作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗有效性评价的有效手段,选择合适的动物模型及合理试验设计对获取有效性、安全性信息及支持临床试验十分重要。目前,非临床常用动物模型包括转基因小鼠、非人灵长类动物、仓鼠、雪貂等。本文就非临床试验中常用动物模型及其在应用中遇到的问题作一综述。

    2023年09期 v.36 1149-1152页 [查看摘要][在线阅读][下载 791K]
    [下载次数:221 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • SARS-CoV-2疫苗不同动物模型攻毒试验常见问题及考虑

    吴爽;王寅;孙涛;

    动物攻毒试验作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗有效性评价的有效手段,选择合适的动物模型及合理试验设计对获取有效性、安全性信息及支持临床试验十分重要。目前,非临床常用动物模型包括转基因小鼠、非人灵长类动物、仓鼠、雪貂等。本文就非临床试验中常用动物模型及其在应用中遇到的问题作一综述。

    2023年09期 v.36 1149-1152页 [查看摘要][在线阅读][下载 791K]
    [下载次数:221 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
  • 下载本期数据