- 靳玉琴;侯俊伟;张靖;陈实;李启明;
目的评价基于汉逊酵母系统的重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLP)的免疫效果。方法将HPV58 L1重组汉逊酵母工程菌转种于3.7 L发酵罐中,经甲醇诱导15 h,收集菌体,高压均质破碎菌体后,采用亲和层析法纯化重组HPV58 L1蛋白,纯化后的HPV58 L1经重构后,经透射电镜观察VLP形态,动态光散射仪分析比较重构与未重构VLP粒径大小及分布情况。将HPV58 L1蛋白(1μg/ml)及HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)分别免疫BALB/c小鼠,免疫后4周采血分离血清,假病毒中和试验比较铝佐剂吸附与未吸附免疫效果;将HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)免疫5组BALB/c小鼠,每组免疫时间均为0、1、3、5、7周,于初次免疫后第1、2、4、6、8周采血,分离血清,假病毒中和试验检测HPV58 L1免疫效果。结果纯化后的重组HPV58 L1蛋白纯度约90%,可与小鼠抗HPV58 L1单克隆抗体发生特异性结合,在相对分子质量约56 000处,可见特异性条带。重构的HPV58 L1VLP直径约为50 nm,界限清晰,颗粒均一度较高,更接近天然病毒的颗粒形态;流体力学直径与天然病毒颗粒更接近,颗粒大小分布更均一,无较小半径的单体或五聚体。HPV58 L1蛋白+佐剂免疫小鼠血清中和抗体滴度明显高于HPV58 L1蛋白免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);5组小鼠血清中和抗体滴度在初次免疫后1周即开始升高,第6周达到最高,重构的重组HPV58 L1蛋白可诱导小鼠产生较高水平的中和抗体。结论应用含铝佐剂的HPV58 L1 VLP免疫小鼠,具有较好的免疫学活性,可作为多价HPV疫苗的组分抗原。
2013年12期 v.26 1697-1700+1704页 [查看摘要][在线阅读][下载 295K] [下载次数：276 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：859 ] - 杨会强;倪谦枝;刘杰;汪伟;孙艳;李玉华;
目的分析2003~2011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.72~7.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.02~7.61 lgPFU/ml。结论连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定,一致性良好,该疫苗质量稳定,安全可靠。
2013年12期 v.26 1701-1704页 [查看摘要][在线阅读][下载 603K] [下载次数：157 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：836 ] - 王雪薇;刘钰;陈敬;焦小玲;王平;张燕斌;林海涛;刘梅影;
目的采用层析法纯化C群脑膜炎球菌多糖,以替代冷酚抽提法,并对制备的多糖蛋白结合物进行初步安全性和免疫原性评价。方法采用温和的表面活性剂去氧胆酸钠对C群脑膜炎球菌多糖进行前处理,并用Capto adhere和Capto DEAE阴离子交换凝胶柱串联,对多糖进行柱层析纯化,再通过脱盐去除残留的去氧胆酸钠,获得精制多糖。对缓冲液中的去氧胆酸钠浓度、缓冲液pH值、样品的前处理时间及离子交换流速进行优化,并对建立的层析纯化工艺进行放大,纯化3批多糖,按照《中国药典》三部(2010版)要求检测各项质控指标,并通过核磁共振-氢谱检测纯化后的多糖结构。将层析法和苯酚法纯化的多糖分别与破伤风类毒素结合,制备多糖蛋白结合物,对结合物进行异常毒性、小鼠急性毒性试验和免疫原性检测。结果经优化,确定缓冲液的去氧胆酸钠浓度为1.0%,pH值为8.0,样品前处理时间为6 h,离子交换流速为2.0 ml/min。放大工艺制备的3批C群脑膜炎球菌多糖各项检测指标均合格,多糖回收率均大于70%,明显高于苯酚法制备的多糖。核磁共振-氢谱显示,层析法与苯酚法纯化的多糖主要峰基本一致,层析法未改变多糖结构。层析法纯化的多糖制备的多糖蛋白结合物异常毒性试验合格,小鼠急性毒性试验结果与苯酚法纯化多糖制备的多糖蛋白结合物比较,差异无统计学意义(P>0.05),免疫小鼠后均具有良好的免疫原性。结论层析法分离杂蛋白操作简便,省时省力,工艺易于放大,且减少了对环境的污染,可替代苯酚抽提法用于C群脑膜炎球菌多糖的纯化。
2013年12期 v.26 1705-1710+1714页 [查看摘要][在线阅读][下载 352K] [下载次数：364 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：803 ] - 赵大鹏;李晓波;任琦;王亚军;支百惠;李晓辕;吴业红;郭雪;张雪梅;
目的评价甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在动物体内的安全性和免疫原性。方法按《中国药典》三部(2005版)方法进行异常毒性试验。将小鼠随机分为7组,每组10只,实验组小鼠分别经小鼠后腿胫前肌肌肉注射不同血凝素含量(15、30、45μg/0.5 ml)的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗,同时设疫苗对照组(相应规格的季节性H1N1流感病毒裂解疫苗)及阴性对照组(PBS),注射剂量均为0.1 ml/只,间隔21 d加强免疫1次,分别于初免后0、21、28、35及42 d采集眼静脉血,分离血清,检测血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体水平。结果异常毒性试验结果符合《中国药典》三部(2005版)判定标准。与阴性对照组比较,初免后21、28、35、42 d,各剂量实验组小鼠血清抗体水平均明显升高,21 d即上升到较高水平,28 d达到峰值(P均<0.01);初免后0、21、28、35、42 d,除35 d外,均高于相应剂量疫苗对照组(P均>0.05)。初免后21 d,15、30、45μg/0.5 ml剂量实验组小鼠血清中HI抗体阳转率分别为80%、90%和90%,HI抗体保护率分别为100%、90%和90%,与相应剂量疫苗对照组相比,差异均无统计学意义(P均>0.05);初免后28、35、42 d,15、45μg/0.5 ml剂量实验组HI抗体阳转率维持在80%以上,30μg/0.5 ml剂量实验组HI抗体阳转率略低,而各剂量实验组HI抗体保护率均在90%~100%之间。结论甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在昆明小鼠中具有良好的安全性和免疫原性。
2013年12期 v.26 1711-1714页 [查看摘要][在线阅读][下载 210K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1113 ] - 程鹏飞;马雷钧;王瑜新;杨菲茹;
目的分析流感病毒裂解疫苗生产用H1N1、H3N2和B型流感病毒毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性。方法对制备的H1N1、H3N2和B型流感病毒毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检定;采用RT-PCR法从3个型别流感疫苗生产用毒株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增血凝素(hemagglutinin,HA)及神经氨酸酶(neuramidinase,NA)基因片段,进行全基因序列测定分析。结果制备的3个型别流感病毒毒株主种子批、工作种子批和疫苗病毒收获液的抗原性与WHO推荐毒株相一致,生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;HA及NA基因核苷酸序列、氨基酸序列均一致,除H3N2型毒株的NA基因序列外,均与GenBank中登录的相应毒种基因序列同源性为100%。结论本公司流感病毒裂解疫苗毒种制备及疫苗生产工艺,能够保持生产用毒株传代生物学特性的一致性及遗传性状的稳定性。
2013年12期 v.26 1715-1718+1724页 [查看摘要][在线阅读][下载 536K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：951 ] - 王一平;徐绣宇;王虹;尹一兵;孟江萍;
目的探讨肺炎链球菌减毒活菌疫苗候选菌株R6的安全性及保护效果。方法将不同剂量的R6和强毒力菌株D39分别经鼻腔感染BALB/c小鼠,通过小鼠毒力试验、定植试验和肺部组织形态观察,评价R6的安全性。将1.0×108cfu的R6菌株与CT佐剂混合后,经黏膜免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG亚型及细胞因子,通过主动、被动保护试验及免疫小鼠体内定植试验,观察R6对免疫小鼠的保护效果。结果不同剂量的R6鼻腔攻毒后,小鼠存活率为100%,显著高于D39阳性对照组(P<0.001),心脏血和脑匀浆标本未见细菌生长,鼻腔灌洗液和肺匀浆中的菌量均显著低于D39阳性对照组(P<0.01),肺部炎症反应较轻,且较快恢复正常。R6菌株与CT佐剂混合后经黏膜免疫的小鼠可产生以IgG1和IgG2b亚型为主的高效价血清IgG,且特异性的细胞因子IL-4、IL-10和IL-17A水平明显升高;可主动保护60%的小鼠抵抗D39的感染,明显高于市售23价肺炎链球菌疫苗(44%),但免疫血清不具有被动保护作用;免疫R6的小鼠可明显减少19F菌株在其呼吸系统的定植。结论肺炎链球菌减毒活疫苗候选菌株R6具有良好的安全性和保护效果,为该疫苗的研发提供了实验依据。
2013年12期 v.26 1719-1724页 [查看摘要][在线阅读][下载 464K] [下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：919 ]
- 曹玉锋;李霄培;陈子杨;王健;常东英;贾媛;张健锋;吴菲;王伟善;时成波;
目的利用原核表达系统融合表达人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1),并进行纯化及鉴定。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对hIGF-1天然基因序列进行同义突变,并人工合成,PCR扩增后,克隆至pET48b(+)载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白Trx A-hIGF-1经Ni2+亲和层析进行纯化,纯化产物经肠激酶酶切后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET48b-Trx A-hIGF-1经菌落PCR及测序证实构建正确;表达融合蛋白相对分子质量约为26 000,表达量约为菌体总蛋白的40%,主要以可溶形式存在于菌体裂解上清中,可溶性蛋白占总目的蛋白的比例不低于90%,纯化后纯度不低于90%,蛋白浓度为0.5 mg/ml;纯化的Trx A-hIGF-1融合蛋白可被肠激酶切割为相对分子质量约为8 000的hIGF-1蛋白和18 000的Trx A蛋白,hIGF-1蛋白可与兔抗hIGF-1多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了hIGF-1融合蛋白,为其生物学活性的研究及规模化生产奠定了基础。
2013年12期 v.26 1725-1728+1733页 [查看摘要][在线阅读][下载 293K] [下载次数：197 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：889 ] - 唐浩;党微旗;曹红;王林;陈婷梅;
目的构建信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)β基因重组腺病毒质粒,并在小鼠乳腺癌4T1细胞中进行表达。方法用HindⅢ和XbaⅠ双酶切质粒pcDNA-Zeo-STAT3β-C4 flag,获得目的基因STAT3β,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将构建正确的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-STAT3β经PmeⅠ酶切线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌(E.coli)BJ5183中,获得重组腺病毒质粒pAd-STAT3β,转染HEK293A细胞,包装出重组腺病毒,经扩增、CsCl梯度离心纯化后,检测病毒滴度。收集病毒,以50 MOI感染小鼠乳腺癌4T1细胞,RT-PCR及Western blot法检测STAT3β水平。结果重组穿梭质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组腺病毒质粒经单酶切鉴定,证明构建正确;扩增、纯化后重组腺病毒滴度可达1.1×1013pfu/ml。重组腺病毒Ad-STAT3β感染的小鼠乳腺癌4T1细胞,在转录和蛋白水平上均有STAT3β基因的表达。结论成功构建了重组腺病毒质粒pAd-STAT3β,并在小鼠乳腺癌4T1细胞中表达目的基因STAT3β,为进一步研究乳腺癌的治疗奠定了基础。
2013年12期 v.26 1729-1733页 [查看摘要][在线阅读][下载 250K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：809 ] - 李凤华;朱战波;江国托;
目的原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性。方法以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2。将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的最佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105IU/ml。结论原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础。
2013年12期 v.26 1734-1737页 [查看摘要][在线阅读][下载 197K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：789 ] - 王黎阳;赵浏阳;彭琼乐;孙艳;柳满然;
目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。
2013年12期 v.26 1738-1742页 [查看摘要][在线阅读][下载 285K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：968 ] - 马吉春;姚冬明;杨静;陈芹;邓兆群;钱炜;钱军;陈星星;安翠;闻向梅;郭竑;林江;
目的探讨肿瘤抗原MUC1抑制骨髓来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)产生的机制。方法分离C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞,分别与稳定表达含22个串联重复序列的全长人MUC1 cDNA片段的B16细胞(B16-MUC1)和空质粒对照B16细胞(B16-neo)培养上清共培养,流式细胞术分析MUC1对MDSC产生及MDSC表达MUC1蛋白的影响;瑞氏姬姆萨染色观察MUC1对骨髓细胞生长形态的影响;流式细胞术检测共培养的骨髓细胞中单核细胞和巨噬细胞标志物CD14和F4/80的表达及成熟单核-巨噬细胞标志物CD11b和CD68的表达。结果正常C57BL/6小鼠骨髓细胞分别与B16-neo和B16-MUC1细胞培养上清共培养24和48 h后,BM+B16-MUC1组骨髓细胞中CD11b+Gr-1+MDSC数量较BM+B16-neo组均明显减少(P<0.05),共培养48 h后,BM+B16-MUC1组的CD11b+Gr-1+MDSC中MUC1蛋白的表达较BM+B16-neo组明显增多(P<0.01);BM+B16-MUC1组骨髓细胞中单核-巨噬细胞数量增多;与BM+B16-neo组相比,BM+B16-MUC1组CD14+、F4/80+和CD68+细胞表达数量明显增高(分别为P<0.01、P<0.01、P<0.05),CD11b+平均荧光强度明显增高(P<0.01)。结论 MUC1通过诱导骨髓细胞向单核-巨噬细胞分化,从而抑制MDSC的产生。
2013年12期 v.26 1743-1747+1752页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K] [下载次数：153 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：690 ] - 尹频;贺勇;查何;周吉;文利;彭惠民;张政;
目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-451对肾小球系膜细胞增殖的抑制作用及其机制。方法在Lipofectamine 2000介导下,将miR-451模拟物(miR-451 mimics)及mimics对照分别转染高糖培养的肾小球系膜细胞,另设高糖未转染组和低糖未转染组,实时荧光RT-PCR法检测各组细胞中miR-451的表达水平;MTT法检测miR-451对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响;Western blot法检测靶蛋白Ywhaz、p-p38 MAPK和p-MKK3的表达水平。结果 miR-451组细胞中miR-451的表达水平较mimics对照组明显升高(P<0.01);miR-451组第2、3、4天的细胞增殖能力明显低于高糖未转染组(P均<0.05),第3、4天明显低于mimics对照组(P均<0.05);与mimics对照组和高糖未转染组比较,miR-451组细胞中Ywhaz、p-p38 MAPK和p-MKK3的表达水平均明显下降(P均<0.05)。结论 miR-451可抑制Ywhaz蛋白的表达,降低p38 MAPK信号途径中p-p38 MAPK和p-MKK3蛋白的表达,从而降低高糖诱导的肾小球系膜的增殖。本实验为研究糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发病机制提供了新的思路。
2013年12期 v.26 1748-1752页 [查看摘要][在线阅读][下载 221K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：784 ] - 郑国君;倪玲;郭德军;
目的通过毕赤酵母GAP启动子高效分泌表达人胰岛素前体,并检测重组胰岛素类似物的生物活性。方法经密码子优化并人工合成人胰岛素前体基因IS基因,插入pGAPZaA组成型表达载体中,构建重组表达质粒pGAPZaIS,电转化至感受态毕赤酵母SM1168菌株中,PCR鉴定阳性重组子;高抗性YPD平板筛选高蛋白表达株并优化表达条件;表达产物经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析;用吸附树脂吸附、阳离子交换层析、超滤纯化后,用经TPCK处理的胰蛋白酶切除人工C肽,经阴离子交换层析和醋酸锌沉淀纯化后,进行Tricine-SDS-PAGE分析;将12只链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的小鼠随机分为A组和B组,A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油的注射用水作为对照组,B组小鼠经腹腔注射用胰岛素类似物配制的0.05 mg/ml注射用水剂(含1.8%甘油),10μl/g,空腹6 h后,断尾取血,用血糖仪检测小鼠血糖值。结果重组表达质粒pGAPZa-IS经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;共获得5株高抗性重组菌,其表达产物均可见相对分子质量约6 000的目的蛋白条带,与小鼠抗胰岛素单克隆抗体不发生特异性反应,5号菌72 h表达量最高;C肽切除后,获得了纯胰岛素类似物;模型小鼠在注射胰岛素类似物6 h后,血糖值均明显降低,B组小鼠注射前后血糖值及A、B组间的血糖值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论在毕赤酵母中,利用GAP启动子成功高效表达了胰岛素前体,并具有良好的降血糖活性。
2013年12期 v.26 1753-1757+1763页 [查看摘要][在线阅读][下载 351K] [下载次数：403 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：802 ] - 宋培培;胡敏;湛晓琴;章帆;施琼;翁亚光;
目的探讨癌基因c-myc对食管癌有丝分裂检查点效应蛋白BubR1的调控作用。方法将Bub1b基因启动子亚克隆至载体pSEAP2-Basic中,构建重组质粒pSEAP2-Bub1b-P2000,在Lipofectamine 2000的介导下,分别转染过表达c-myc的HEK-293细胞(经Ad-c-myc感染)和ECA-109细胞;转染6 h后,经c-myc抑制剂10058-F4作用ECA-109细胞。SEAP化学发光法检测各组细胞的ALP活性;采用RT-PCR和Western blot法分别检测抑制c-myc表达的ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平。结果重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定构建正确;重组质粒转染过表达c-myc的HEK-293细胞和抑制c-myc表达ECA-109细胞的ALP活性明显升高(P<0.000 1);抑制c-myc表达可明显下调ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平(P<0.05)。结论癌基因c-myc对食管癌细胞中BubR1的表达有正调控作用,为进一步研究BubR1在食管癌中发挥的作用奠定了基础。
2013年12期 v.26 1758-1763页 [查看摘要][在线阅读][下载 331K] [下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：819 ] - 赫慧琛;姜晓杰;高金亮;徐萌杰;王英;王文杰;李炜;祁美荣;
目的原核表达并纯化钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。方法利用PCR技术扩增钝顶螺旋藻sod基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-sod,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白SOD-GST利用蛋白纯化树脂Glutathione SepharoseTM4 Fast Flow纯化后,采用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果重组表达质粒pGEX-4T-sod经双酶切和测序证实构建正确;表达的融合蛋白SOD-GST的相对分子质量约为49 000,表达量占菌体总蛋白的30.2%,在重组菌裂解上清和沉淀中均有融合蛋白的表达;纯化的融合蛋白纯度为82.4%,浓度为2.8 mg/ml,从可溶性表达产物中纯化的酶的比活性为1 440 U/mg。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化了具有生物学活性的钝顶螺旋藻SOD,为其产业化生产奠定了基础。
2013年12期 v.26 1764-1767页 [查看摘要][在线阅读][下载 188K] [下载次数：183 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：805 ] - 张雄;孙洁芸;高敏娜;李昱;
目的探讨过表达脑红蛋白(neuroglobin,NGB)对水溶性β-淀粉样蛋白片段1-42(beta-amyloid1-42,Aβ1-42)诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用及其机制。方法将质粒pEGFP-NGB转染经Aβ1-42诱导损伤的SH-SY5Y细胞,MTT法检测NGB对损伤细胞存活率的影响;JC-1染色法检测NGB对损伤细胞线粒体膜电位的影响;免疫细胞化学法及Western blot法分别检测损伤细胞中细胞色素C(cytochrome C,cytoC)和caspase-3、caspase-9的表达水平。结果过表达NGB可明显提高Aβ1-42诱导损伤的SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),抑制损伤细胞线粒体膜电位的降低(P<0.01),使损伤细胞内cytoC和caspase-3、caspase-9蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05)。结论 NGB可通过抑制与细胞凋亡密切相关的cytoC、caspase-3和caspase-9等蛋白的表达而发挥其神经保护作用。本实验为阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的治疗提供了实验依据。
2013年12期 v.26 1768-1771页 [查看摘要][在线阅读][下载 214K] [下载次数：132 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：821 ] - 李策生;邹莉;李陶敬;胡勇;邢延涛;彭焱;周雁翔;李娟;
目的研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响。方法取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C 3种配方(氯化钠浓度为C<A<B)缓冲液,经超滤透析制备人凝血因子Ⅷ半成品后,加入>6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的最佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测。结果在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为最佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02)LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)%。结论已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性。
2013年12期 v.26 1772-1775页 [查看摘要][在线阅读][下载 194K] [下载次数：328 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1037 ] - 刘姗;周晓燕;秦茹;舒逸;邹琳;
目的比较儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)CD34+CD38-细胞群在非肥胖糖尿病(non obese diabetic,NOD)/重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠与在NOD/SCID基础上敲除IL-2Rγ链的小鼠(NOD scid gamma,NSG)体内的复制能力。方法采用免疫磁珠法分选ALL患儿骨髓CD34+CD38-细胞(作为阳性细胞)及其他各群细胞(CD34+CD38+、CD34-CD38-、CD34-CD38+,作为阴性对照细胞),经尾静脉分别注射于NOD/SCID或NSG小鼠体内,104个/只,连续监测小鼠的发病情况并记录小鼠生存时间;进行小鼠外周血白血病细胞计数及外周血、骨髓血涂片检查;将濒死小鼠处死后,取肝、脾组织,进行病理学检查。结果 CD34+CD38-细胞注射入小鼠体内后,NOD/SCID小鼠的存活期为56~150 d,NSG小鼠的存活期为13~120 d;NOD/SCID小鼠外周血白细胞数量缓慢升高直至死亡或处死,NSG小鼠外周血白细胞数量从第7天开始升高,至75 d左右达高峰;NOD/SCID小鼠和NSG小鼠分别于注射CD34+CD38-细胞3周和2周后外周血涂片可见白血病细胞,NSG小鼠外周血涂片发现更多的蓝染幼稚细胞;NSG小鼠骨髓涂片中发现更多的圆形、外源整齐、蓝色深染的幼稚细胞;NSG小鼠脾脏组织中有明显的炎细胞团块,且组织疏松,NOD/SCID小鼠脾脏组织中未发现明显的炎细胞团块,且组织相对致密,两种小鼠的肝脏组织中均未发现明显的炎细胞团块和组织结构改变。结论 ALL CD34+C38-细胞在NOD/SCID小鼠及NSG小鼠体内均能增殖复制出白血病,NSG小鼠复制白血病的时间更短,恶性程度更高,且白血病的复制过程更接近人类白血病的病理过程。本实验为白血病发病机理的研究和临床用药的评价提供了更好的载体。
2013年12期 v.26 1776-1780页 [查看摘要][在线阅读][下载 364K] [下载次数：278 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1146 ]
- 范文红;韩春梅;李响;毕华;丁有学;刘兰;饶春明;王军志;
目的建立重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法分别采用分子筛高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)、反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)和还原毛细管电泳(reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,rCE-SDS)测定3批重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白成品的纯度;采用AlphaScreen组氨酸检测试剂盒进行重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白受体配体结合试验测定效价;采用ELISA法进行鉴别试验;蛋白含量、pH值、渗透压摩尔浓度、Tween-20、不溶性微粒、外观、澄清度、生物学活性、水分、内毒素、无菌试验、异常毒性、渗透压等项目的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果 SE-HPLC、RP-HPLC及rCE-SDS测定3批供试品的纯度分别为>98%、>80%和>99%;重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白对血管生成素(angiopoietin,Ang)与酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains,Tie)结合的抑制作用呈剂量依赖性,3批供试品与标准品的剂量反应曲线相同,呈典型的倒S型,R2均>0.98,结合效价均在平均值的正负25%区间内;3批供试品的S/N值均>1.60;其他项目检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论建立的质控方法具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。
2013年12期 v.26 1781-1784+1788页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K] [下载次数：341 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：754 ] - 柯大智;王建伟;王红宁;顾恒伟;陈地龙;龙轩;王亚平;李春莉;
目的探讨人参皂苷单体Rb1对人慢性粒白血病细胞K562增殖和分化的影响及其细胞内信号转导机制。方法取对数生长期的K562细胞,分别加入不同浓度(20、40、80、160、320μmol/L)的Rb1,MTT法检测其对K562细胞增殖的影响;加入浓度为160μmol/L Rb1,收集培养24、48和72 h的细胞,经Wright染色后,镜下观察Rb1诱导K562细胞成熟分化情况;Western blot法检测培养12、24、48和72 h的细胞中JAK2、STAT5、p-JAK2及p-STAT5的表达水平。结果浓度为20~160μmol/L的Rb1对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性,作用48 h时抑制率达最高;经Rb1诱导后,K562细胞体积缩小,核直径减小,核和浆的比例降低,细胞向成熟方向分化;JAK2的表达水平随Rb1作用时间的延长而提高,p-JAK2的表达随着作用时间的延长而降低;各组间STAT5蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05),但p-STAT5表达于作用48 h时开始降低,并持续至72 h。结论人参皂苷单体Rb1可抑制人慢性粒白血病细胞K562增殖并诱导其向成熟方向分化,JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化在细胞增殖及诱导分化的信号转导过程中发挥重要作用。本实验为治疗白血病天然中药的研发提供了实验依据。
2013年12期 v.26 1785-1788页 [查看摘要][在线阅读][下载 213K] [下载次数：174 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1177 ] - 郭洁;柳青海;李天才;
目的检测牦牛肝蛋白BGP对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其体外抗癌活性。方法用不同浓度的BGP分别作用于人肝癌HepG2细胞,作为实验组,同时设未处理细胞对照组和空白对照组,采用MTT法检测BGP(25、50和100 mg/L)作用HepG2细胞12、24、36和48 h对细胞增殖活性的影响,并于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用流式细胞仪检测BGP(25、50、75、100 mg/L)作用HepG2细胞24 h,对细胞周期及凋亡的影响。结果不同浓度的BGP均可抑制HepG2细胞增殖,与未处理细胞对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),其中100 mg/L BGP作用48 h,对HepG2细胞抑制率最高(94.99%)。各浓度BGP实验组HepG2细胞形态发生明显改变,细胞间隙加大,细胞间连接不牢固,胞内颗粒增多,呈现生长受阻状态,甚至有细胞脱落,细胞数目减少,其中100 mg/L BGP作用48 h,凋亡细胞明显增多。不同浓度BGP作用HepG2细胞24 h后,均可不同程度抑制HepG2细胞生长并诱导细胞凋亡;与未处理细胞对照组相比,S期细胞比例明显升高(除25 mg/L BGP实验组),G0/G1期和G2/M期细胞比例明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论牦牛肝蛋白BGP可抑制HepG2细胞增殖,并促进凋亡,具有明显的体外抗肝癌活性。
2013年12期 v.26 1789-1792+1796页 [查看摘要][在线阅读][下载 254K] [下载次数：94 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：692 ]
- 夏青娟;李树林;孟凡东;赵淑杰;徐晓霞;惠琪;刘令九;
目的制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAV IgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价最高为1∶16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25~70℃条件下处理15 min及经pH 3.0~10.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62~2 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。
2013年12期 v.26 1793-1796页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：815 ] - 宋爱京;许四宏;李秀华;聂建辉;赵晨燕;刘强;黄维金;王佑春;
目的评价国产第四代HIV血液筛查试剂的质量。方法利用HIV-1 p24抗原国家参考品和HIV抗体国家参考品,对2012年3月~2013年3月间7个厂家(A~G)生产的33批第四代HIV血液筛查试剂进行评价。分析A(进口)、B、C试剂对HIV-1 p24抗原弱阳性国家参考品P5检测的S/CO值的变化趋势,及其对HIV-1 p24抗原弱阳性国家参考品P5、强阳性HIV-2型抗体国家参考品18号和中等强度阳性HIV-2型抗体国家参考品19号检测的批间变异系数,计算不同试剂的最低检出量理论值。结果各试剂均符合国家参考品的要求,除A(进口)和C试剂外均有非特异阳性出现。国内、外试剂检测结果均较稳定,未见超过±3 SD的异常结果。P5、18号、19号参考品的批间变异系数均不高于25%,A(进口)试剂的批间精密性优于国产同类试剂。p24抗原参考品最低检出量均值为3.2 IU/ml。82%(27/33)试剂优于HIV-1 p24抗原最低检出量国家标准要求,70%(23/33)的试剂优于HIV抗体最低检出量国家标准要求。结论 2012年3月~2013年3月期间国产第四代HIV血液筛查试剂均符合国家现行标准,但与进口试剂相比,国产第四代HIV血液筛查试剂在最低检出量和批间精密性上尚有提高的空间。
2013年12期 v.26 1797-1800页 [查看摘要][在线阅读][下载 200K] [下载次数：260 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：805 ] - 常娅莉;席仲兴;吴智远;徐秉臣;张正雷;韩少波;热娜;雷刚;彭林锋;卜培英;袁浩嘉;王秉翔;
目的研制鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用纯化的鼠疫菌F1抗原作为包被抗原,HRP标记的F1抗原作为酶标抗原,建立鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、敏感性、特异性、准确性和稳定性验证。结果鼠疫菌F1抗原的最佳包被浓度为0.6μg/ml,HRP标记的F1抗原的最佳工作浓度为1︰7 000。制备的试剂盒检测精密性质控品的板内变异系数为6.5%,板间变异系数为7.1%;检测高、中、低浓度内部质控品和精密性质控品的回收率在95%~112%之间;检测阳性血清和阴性血清的敏感性为100%;与正常人血清、正常兔血清、正常小鼠血清、兔抗假结核耶尔森菌血清、小鼠抗假结核耶尔森菌血清均无交叉反应;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,达到了体外诊断试剂的注册要求,可用于鼠疫的临床监测、诊断及预后判断。
2013年12期 v.26 1801-1804页 [查看摘要][在线阅读][下载 201K] [下载次数：223 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：864 ]
- 邹光荣;兰红;项美娟;杨汝沛;杨晓明;侯启明;张量智;王丽蝉;李军;陈伟;张良豪;王前喜;
目的观察武汉生物制品研究所有限责任公司(以下简称武汉公司)吸附无细胞百白破联合疫苗(diphtheria,tetanus and acellular pertussis combined vaccine,DTaP)的免疫原性和免疫持久性。方法于2007年9月在成都地区选择670名未接种过百白破联合疫苗,无百日咳、白喉、破伤风疾病史的足月出生的健康婴儿,按2∶1比例随机接种3剂观察疫苗(武汉公司生产的DTaP)和对照疫苗(某厂家生产的DTaP),进行基础免疫,每剂间隔1个月,2009年3月进行加强免疫,接种剂量均为0.5 ml/(剂·人)。基础免疫接种前和全程接种后30~50 d、加强免疫前和加强免疫后1个月、1、2、3年分别采集静脉血,分离血清,经ELISA法测定百日咳毒素抗体(pertussis toxin antibody,PTAb)、丝状凝集素抗体(filamentous hemagglutinin antibody,FHA-Ab)、白喉抗体(diphtheria antibody,D-Ab)、破伤风抗体(tetanus antibody,T-Ab)GMT,若免疫前抗体为阳性,则计算4倍增长率。结果基础免疫试验组351例、对照组193例完成了全程接种,即544例受种者符合方案要求。DTaP基础免疫后,试验组与对照组的4种抗体阳转率及抗体4倍增长率差异均无统计学意义(P>0.05);试验组FHA-Ab GMT明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。加强免疫前,试验组与对照组4种抗体阳转率差异无统计学意义(P>0.05);加强免疫后1个月,试验组FHA-Ab阳转率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);加强免疫后1、2、3年,试验组与对照组4种抗体阳转率和抗体GMT差异均无统计学意义(P>0.05);加强免疫后1年,4种抗体GMT均高于有效保护水平,加强免疫后2年,PT-Ab和FHA-Ab GMT已降至保护水平以下,加强免疫后3年,D-Ab、T-Ab GMT仍高于保护水平。结论武汉公司生产的DTaP具有较好的免疫原性和免疫持久性。
2013年12期 v.26 1805-1808+1811页 [查看摘要][在线阅读][下载 195K] [下载次数：415 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：802 ] - 郑俐敏;黄素玲;孙志坚;
目的探讨不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性。方法在江西省上饶市卫生学校抽取乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阴性、健康状况良好的15~20岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和10~499 mIU/ml的分布显著低于A组和C组(P<0.01或<0.001)。有1名接种者在接种后0.5 h有局部疼痛症状,第2天疼痛消失,未见其他局部及全身不良反应。结论接种高剂量乙肝疫苗的抗-HBs阳转率和抗-HBs GMC水平均高于低剂量乙肝疫苗,提示青年应接种高剂量乙肝疫苗,以建立有效的防御乙肝的免疫屏障。
2013年12期 v.26 1809-1811页 [查看摘要][在线阅读][下载 129K] [下载次数：147 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：748 ] - 祁庆贺;哈杰;范学彬;
目的监测2012年吉林省蛟河市14周岁以下儿童麻疹和脊髓灰质炎抗体水平,评估适龄儿童免疫水平。方法随机调查了蛟河市9个乡镇的14周岁以下儿童3 157名,采用ELISA法检测麻疹和脊髓灰质炎IgG抗体水平,并采用Excel 2003软件及卡方检验计算器V1.61统计软件进行统计学分析。结果不同乡镇儿童脊髓灰质炎IgG抗体阳性率在93.29%~98.70%之间,样本总体阳性率为97.02%;麻疹IgG抗体阳性率在94.59%~98.55%之间,样本总体阳性率为96.0%;各乡镇间儿童脊髓灰质炎IgG抗体阳性率差异有统计学意义(P<0.05),各乡镇间儿童麻疹IgG抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.10)。不同年龄组儿童脊髓灰质炎IgG抗体阳性率在96.30%~97.74%之间,麻疹IgG抗体阳性率在95.17%~97.74%之间;各年龄组间儿童脊髓灰质炎IgG抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05),各年龄组间麻疹IgG抗体阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。结论蛟河市14岁以下儿童人群具有较高的脊髓灰质炎和麻疹免疫抗体水平,已形成了有效的针对麻疹和脊髓灰质炎的免疫屏障。
2013年12期 v.26 1812-1813页 [查看摘要][在线阅读][下载 90K] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：747 ]
- 王保成;蔡峰;李坤;李春阳;张珂;秦娇荣;
目的采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子I型受体(soluble tumour necrosis factorαreceptors I,sTNFα-RⅠ)的聚乙二醇(PEG)修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数。方法采用UNICORN(DoE)软件中Central Composite Face Centered(CCF)模型对sTNFα-RⅠ的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值(pH)、反应时间(Time)和PEG与蛋白质量比(PEGrate)进行优化,设置4个响应值(多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值)揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法(Monte-Carlo Simulation)对优化参数进行风险评估。结果 3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于最低值和最高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数(R2)均>0.75,预测准确性(Q2)>0.5,模型有效性(Model Validity)>0.25,重复性(Reproducibility)>0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围(-4~4)之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果。溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time·PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化。确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22~35 h之间,PEG与蛋白质量比控制在2.5~4.0之间,符合预设值;蒙特-卡罗模拟法对在最佳操作参数(反应时间34.1 h,溶液pH值6.5,PEG与蛋白质量比2.5)时模型预测的响应值(单PEG修饰产物峰面积值5 635.82和单PEG修饰产物与多PEG修饰产物比值3.226 5)的风险评估,10万次模拟试验可信度分别为99.825%和99.982%,试验风险较小,工艺可控。结论确定了sTNFα-RⅠ蛋白PEG修饰稳健的工艺参数。
2013年12期 v.26 1814-1822+1826页 [查看摘要][在线阅读][下载 739K] [下载次数：222 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：823 ] - 张瑾;王瑾;杨英超;张影;薄淑英;王国柱;辛晓芳;
目的采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定钩端螺旋体疫苗中的苯酚含量。方法色谱条件:色谱柱:Novo-Pak C-18层析柱(3.9 mm×150 mm,4μm),流动相:甲醇-超纯水(40∶60,v∶v),流速:1.0 ml/min,检测波长:270 nm,柱温:30℃,进样量:10μl。对建立的方法进行线性范围、精密性、重现性、准确性验证及初步应用。结果苯酚浓度在18.552~129.864μg/ml范围内,色谱峰面积与苯酚浓度呈良好的线性关系(r=0.999 7);苯酚对照品溶液连续进样6次,主峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.25%,保留时间的RSD为0.10%;用建立的方法检测6份钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的RSD为0.5%;准确性试验的总平均回收率为100.6%,RSD为1.0%;HPLC法和溴量滴定法测定4批钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的结果基本一致。结论 HPLC法可以更准确地测定苯酚含量,且该方法操作简便、快速,精密性高,重现性好,无干扰,适用于钩端螺旋体疫苗成品中苯酚含量的检测。
2013年12期 v.26 1823-1826页 [查看摘要][在线阅读][下载 211K] [下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：853 ] - 刘杰;刘辉;杨会强;康庄;孙艳;毛川成;何敏;李玉华;
目的采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA。方法采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价。结果 0.45μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求。
2013年12期 v.26 1827-1830页 [查看摘要][在线阅读][下载 153K] [下载次数：473 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：809 ] - 杨军;梁凌宇;高雪峰;周晖国;蒋琳;
目的建立一种快速检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇和乙酸含量的方法。方法采用HPLC法检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量:使用Aminex誖HPX-87H column(300 mm×7.8 mm,9μm),以5 mmol/L H2SO4溶液作为流动相,在柱温35℃、流速0.60 ml/min的条件下,用示差折光检测器进行检测,采用外标法定量。对方法进行系统适用性、专属性、检测限、定量限、线性范围、准确性、精密性验证及初步应用。结果各物质色谱峰理论塔板数均大于8 500,各峰之间的分离度均大于4.5,阴性对照在相应位置处未见色谱峰;在标准曲线线性范围内,乙酸、葡萄糖、甘油、甲醇浓度与峰面积均呈良好的线性关系,相关系数在0.999 97~0.999 98之间;该方法检测葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的平均加样回收率分别为102.18%、103.84%、105.16%、102.82%;该方法重复6次检测发酵液,其中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸峰面积的RSD分别为0.15%、0.21%、0.23%、0.23%。该方法对重组大肠埃希菌和毕赤酵母发酵过程中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量进行检测,结果能够满足发酵操作的要求。结论建立的HPLC法系统适用性和专属性良好,加样回收率和精密性较高,不受培养基中蛋白胨、酵母粉和其他代谢产物的影响,可应用于基因工程菌发酵过程中3种碳源和乙酸含量的检测。
2013年12期 v.26 1831-1834页 [查看摘要][在线阅读][下载 246K] [下载次数：299 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：852 ] - 邓杰;张珂;袁涛;李春阳;
目的建立检测白喉毒素突变体CRM197细菌内毒素(bacterial endotoxin)含量的动态显色法(kinetic chromogenic assay,KCA)。方法按照《中国药典》三部(2010版)要求,用细菌内毒素检查用水(bacterial endotoxin,BET)稀释细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准曲线系列溶液,各浓度均设3个平行孔,分别与动态显色鲎试剂(kinetic chromogenic analysis tachypleus amebocyte lysate,KCA TAL)反应,绘制标准曲线,验证标准曲线的可靠性,确定最佳线性范围、测定范围及最低检测限(limit of quantitation,LOQ),验证方法的精密性和准确性,并进行初步应用。结果标准曲线的回归方程为:y=-0.263 x+2.741,R2=0.997,相关系数的绝对值∣r∣≥0.980,阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间,各复孔的变异系数(CV)<10%;内毒素浓度在0.02~2.50 EU/ml时,线性关系良好,LOQ为0.02 EU/ml;3个浓度(2.50、0.50、0.02 EU/ml)标准内毒素检测结果的CV均<5%,加入高、中、低3个浓度(2.50、0.50、0.02 EU/ml)标准内毒素的3批供试品检测结果的CV均<10%,回收率在95%~143%之间;采用建立的方法检测10批次CRM197样品的细菌内毒素含量,回收率在77%~118%之间,其中8批样品的内毒素含量合格。结论动态显色法检测CRM197中内毒素的含量精密性和准确性良好,能快速、定量检测样品中的内毒素含量,抗干扰能力强,可用于CRM197研制过程中的质量控制。
2013年12期 v.26 1835-1839页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] [下载次数：213 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：873 ] - 孙玉杰;马锐;马晓宇;刘旭;王瑜;盛玉博;王辉;黄浩;陈兴;赵铠;李津;
目的采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析重组酿酒酵母表达的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结构性状。方法采用HPLC法,分别以磷酸盐缓冲液和含去垢剂SDS的磷酸盐缓冲液为流动相,分析3批重组酿酒酵母表达的纯化HBsAg VLP的出峰规律。结果 3批纯化的HBsAg样品在不含SDS的流动相条件下,均只在(15.39±0.01)min处出现单一的相对分子质量2 000 000的HBsAg VLP峰,峰面积积分百分含量为(100.00±0.0)%。3批纯化的HBsAg样品在含SDS的流动相条件下,在(15.07±0.02)min处出现相对分子质量2 000 000的HBsAg VLP峰,峰面积积分百分含量为(55.07±0.05)%;在(28.62±0.04)min处出现1个相对分子质量24 000的P24亚基多肽峰,峰面积积分百分含量为(44.93±0.04)%。结论 HBsAg在常规保存条件下为P24亚基通过非共价键或(和)共价键聚合形成的相对分子质量为2 000 000的大分子蛋白颗粒,在含SDS的条件下,HBsAg颗粒可部分解聚为P24亚基。
2013年12期 v.26 1840-1843页 [查看摘要][在线阅读][下载 345K] [下载次数：229 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：950 ] - 郑朝共;许锬;容新宗;黄琰;
目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%~2.81%,试验间CV为1.23%~2.21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。
2013年12期 v.26 1844-1847+1850页 [查看摘要][在线阅读][下载 354K] [下载次数：244 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：748 ] - 赵永强;杨丽;白春杰;刘瑞;
目的比较不同截留分子量超滤膜包浓缩狂犬病病毒(rabies virus,RV)的效果。方法将RV固定毒3aG-V株按0.01 MOI比例接种至Vero细胞中,制备RV原液,分别用截留分子量100 KD和300 KD的膜包超滤浓缩60倍,β-丙内酯灭活后,验证病毒液浓缩过程膜下液的病毒灭活效果;采用Sepharose 4FF凝胶层析纯化灭活的病毒浓缩液,Lowry法测定病毒浓缩液和纯化液中的蛋白质含量;酶联免疫法测定病毒浓缩过程膜下液、浓缩液和纯化液中的RV抗原含量。结果 100 KD和300 KD的超滤膜包均能有效截流RV,3次试验膜下液RV抗原含量均为0 IU/ml,观察期内小鼠均健存。300 KD膜包超滤的浓缩液和纯化液比100 KD超滤膜包超滤的浓缩液和纯化液中杂蛋白含量低,抗原含量高。结论截留分子量300 KD的膜包比100 KD的膜包更适用于RV的浓缩。
2013年12期 v.26 1848-1850页 [查看摘要][在线阅读][下载 122K] [下载次数：559 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1117 ]