- 牛香莲;张光明;吴晋元;米鍇;谢力;孙晓琴;李鸿钧;孙茂盛;
目的评价灭活轮状病毒疫苗(inactivated rotavirus vaccine,IRV)与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组:联合免疫组接种IPV后4周,经双侧腿同时免疫IPV和IRV,共2次,间隔4周;单疫苗免疫组2组,分别免疫3针IPV和2针IRV,每针均间隔4周;间隔免疫组免疫1针IPV后4周,开始进行IPV和IRV间隔免疫(每针间隔2周,共6周)。分别于每次免疫后4周经尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验结合免疫荧光抑制方法检测血清抗RV中和抗体水平,ELISA法检测血清抗RV特异性Ig G抗体水平,微量中和试验法检测血清抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平。结果大鼠经2针IRV免疫后,血清抗RV中和抗体和特异性Ig G抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)均明显上升,血清抗体阳转率均达100%;经3针IPV免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体GMT均明显上升,抗体阳转率均达100%;联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组间血清抗RV中和抗体水平、特异性Ig G抗体水平及抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IRV和IPV免疫大鼠后均获得到良好的免疫效果,两种疫苗联合使用时,免疫效果无相互干扰作用。
2015年03期 v.28 217-222页 [查看摘要][在线阅读][下载 281K] [下载次数：242 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张莹;刘龙丁;董承红;王丽春;廖芸;郭磊;王晶晶;梁燕;冯敏;崔伟;李琦涵;
目的分析不同批次的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)全程免疫后免疫原性及安全性的一致性。方法检测3批EV71灭活疫苗成品的抗原含量、游离甲醛含量、铝含量、内毒素含量、抗生素残留量,并免疫动物检测异常毒力及效力。采用随机、双盲的方法,将3批疫苗于第0、28天分别免疫900名6~72月龄的受试人群。于接种前(第0天)、完成2剂疫苗接种后28天(第56天),采集静脉血,分离血清,采用微量细胞病变法检测EV71中和抗体(neutralizing antibody,Nab)效价;于每次接种后30 min内记录即时反应,每剂接种后0~7 d内记录各种征集性局部和全身症状,0~28 d内记录非征集性不良反应事件,并在整个观察期间报告严重不良反应事件。结果 3批EV71灭活疫苗成品的各项检定结果均在合格范围内。经2剂EV71灭活疫苗全程免疫后,20120101、20120102和20120203批疫苗受试者的抗体阳转率分别为98.00%、95.67%和98.67%,易感人群(Nab<1∶8)免后抗体阳转率分别为96.45%、92.44%和97.60%,非易感人群(Nab≥1∶8)免后抗体水平的4倍增长率分别为67.94%、65.63%和71.43%;免后抗体GMT分别为283.79、231.48和285.78,组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。3批疫苗诱导的与疫苗相关的不良反应及严重不良反应事件,组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过比较3批疫苗的各项生产质量控制指标及其诱导的抗体水平,证实该疫苗的生产工艺较稳定。
2015年03期 v.28 223-227+232页 [查看摘要][在线阅读][下载 302K] [下载次数：379 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 陈成;魏东;李恪梅;付丽丽;黄长江;王国治;
目的探讨布氏菌活疫苗皮内注射小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。方法将30只小鼠随机分为3组,每组10只,分别为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(2×108个/只)和生理盐水对照组,3组均经后肢皮内注射布氏菌活疫苗,0.1 ml/只。免疫4周后,摘眼球取血,分离血清,制备脾脏淋巴细胞,ELISA法检测小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数;ELISA法检测体外再刺激后小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ水平;流式细胞术对T细胞亚群进行分类。用羊布氏菌M5弱毒株攻击免疫小鼠,通过脾脏荷菌量评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低、高剂量组小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价均较高,几何平均滴度分别为642和557;低、高剂量组小鼠在Br-PPD抗原刺激下,分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数以及脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ含量,与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.05);CD4+IFNγ+、CD4+IL-4+比例均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);低、高剂量组小鼠脾脏荷菌量为0,对照组小鼠为(5.13±0.16)log10 CFU。结论采用皮内注射布氏菌活疫苗的方式免疫小鼠后,能获得较强的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。
2015年03期 v.28 228-232页 [查看摘要][在线阅读][下载 293K] [下载次数：211 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 刘景会;刘玉林;褚迪;车薇薇;
目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。
2015年03期 v.28 233-238+244页 [查看摘要][在线阅读][下载 638K] [下载次数：139 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 杨汐静;张建新;陈晓亭;汤炜;于思淼;刘伟;姚笛;吴志军;于立权;朱战波;崔玉东;
目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。
2015年03期 v.28 239-244页 [查看摘要][在线阅读][下载 522K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨旭;夏烨;李亚东;金晓媚;龙琼;孙文佳;黄惟巍;刘存宝;姚宇峰;马雁冰;
目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。
2015年03期 v.28 245-250+256页 [查看摘要][在线阅读][下载 624K] [下载次数：206 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 崔成成;王应明;毕艳红;李攀;杨思达;黄芬;曾韦锟;井申荣;
目的从污水和土壤中富集的微生物菌体中筛选原核增强子样序列,构建包含增强子样序列的表达载体,并通过构建缺失突变体鉴定其功能区域。方法将人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)主要衣壳蛋白基因L1截短序列L11与氯霉素乙酰转移酶基因(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)连接,作为报告基因,从污水和土壤富集的微生物菌体中筛选具有增强子活性的序列,构建包含增强子样序列的表达载体,表达HPV L11蛋白,检测其增强活性;通过构建ER1的缺失突变体,测定不同突变体对L11蛋白表达的作用情况,确定其功能区域。结果从样品基因组DNA中筛选出1条具有一定增强蛋白表达功能的增强子样序列,可使检测菌株氯霉素抗性提高5倍,HPV L11蛋白表达水平提高1.78倍。其增强活性主要位于117~317 bp区域。结论从污水和土壤中成功筛选到1条增强子样序列,携带有增强子样序列的表达载体可提高目的蛋白表达水平。
2015年03期 v.28 251-256页 [查看摘要][在线阅读][下载 592K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 舒放;王晓岩;雷迎峰;林芳;王希;李斌;刘冲;张惠中;韦三华;
目的制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定。方法采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体p CI-HBSE1、p CI-HBSE2、p CI-HBSE3、p CI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBs Ag定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应。结果电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度最高的VLPs-SE2 HBs Ag含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平。结论成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础。
2015年03期 v.28 257-260+265页 [查看摘要][在线阅读][下载 504K] [下载次数：135 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 尹辉;赵达;陈为宏;高佳滨;乔波;陈楠楠;胡旭;梁鸿儒;姜东君;王鹤;朱战波;
目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。
2015年03期 v.28 261-265页 [查看摘要][在线阅读][下载 445K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 杨阳;付加芳;徐晓斌;王世立;
目的原核表达促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,Gn RH)类似物,并进行纯化。方法人工合成8拷贝Gn RH类似物基因,并利用同尾酶技术构建16拷贝的Gn RH类似物基因,将8和16拷贝串联的Gn RH类似物基因分别克隆至p GEX-2t原核表达载体上,构建Gn RH类似物基因多拷贝串联表达的重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21,利用优化后的IPTG诱导表达条件表达的重组Gn RH类似物蛋白经Glutathione Sepharose 4B柱纯化并酶解后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒p GEX-2t-8Gn RH analogue和p GEX-2t-16Gn RH analogue经双酶切及测序证明构建正确。当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导2 h时,破菌后上清中目的蛋白表达量最高。表达的重组蛋白相对分子质量约37 000,可与兔抗Gn RH单克隆抗体特异性结合,纯化后的重组蛋白相对分子质量约1 400,蛋白浓度约260μg/ml。结论已成功构建Gn RH类似物多拷贝基因重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达,为多拷贝法生产生物活性小肽Gn RH类似物奠定了基础。
2015年03期 v.28 266-270页 [查看摘要][在线阅读][下载 495K] [下载次数：85 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 付世新;邓清华;韩盈盈;杨文涛;李小兵;王哲;
目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%(P<0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%(P<0.05)。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。
2015年03期 v.28 271-275页 [查看摘要][在线阅读][下载 419K] [下载次数：70 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 房月芹;崔文璟;崔幼恬;陈艳;周哲敏;
目的通过计算机辅助半理性设计对热不稳定的恶臭假单胞菌Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)分子进行改造,提高酶催化的热稳定性和活性。方法以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone 5-MGAM-4DNHase作为模板,利用位点靶向氨基酸重组(site-targeted amino acid recombination,STAR)软件和分子动力学模拟分析选择合适的同源靶片段,通过同源交换替换Pseudomonas putida NRRL-18668NHase相应的片段,构建7株分别含有3种不同来源片段的新型杂合NHase,检测其热稳定性及活性;圆二色光谱分析野生酶和杂合酶3AB的二级结构。结果 7株杂合NHase(1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC)经50℃热处理10 min后,与野生型NHase相比,热稳定性分别提高了1.5~3.5倍,其中杂合NHase 3AB的热稳定性提高了3.5倍,酶活力提高了1.4倍;野生酶和杂合酶3AB二级结构中α螺旋含量分别为(34.56±3.21)%和(36.88±1.41)%,,β折叠含量分别为(19.78±3.21)%和(18.69±1.74)%。结论通过利用热稳定性的同源片段来替换相应的热不稳定结构域这种理性设计的方法,成功将不耐热的NHase改造成耐热杂合NHase,同时提高了酶的比活力,并能维持NHase分子的基本二级结构不改变。
2015年03期 v.28 276-280+284页 [查看摘要][在线阅读][下载 542K] [下载次数：167 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 牛燕;张良艳;李恒彬;邢丽;石辛甫;于姝;
目的分析MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tian Tan strain,VTT)终身免疫保护性的相关性。方法将VTT分别经肌肉注射免疫C57/BL6小鼠和MIP-1a的KO小鼠模型B6.129P2-Ccl3,每只剂量2×107PFU/ml,每组10只,30和180 d后,再次用相同剂量的VTT进行激发,激发3 d后,处死小鼠,取脾淋巴细胞,采用流式细胞术分析CD44+CD62L-CD4+的外周效应记忆性T细胞(effector memory T cell,Tem)在两种小鼠体内的差异;同时用四聚体(tetramer)对荷载痘苗病毒特异性的CD8+T细胞表位(VACV-B8R20-27 Kb)进行染色,分析MIP-1a的缺失对长效免疫记忆的影响。结果获取的CD4+的记忆性T细胞的表型以CD4+CD44+CD62L-为主,即以Tem为主;获取的CD8+的记忆性T细胞也以Tem(CD44+CD62L-)为主,数量很少。B6.129P2-Ccl3小鼠受到再次激发后,体内VTT特异性CD8+T细胞在30和180 d的比例均明显少于C57/BL6小鼠;在30 d激发时,tetramer+CD8+T细胞的比例明显高于180 d激发。结论 MIP-1a细胞因子与痘苗病毒产生长效免疫记忆相关,本实验为延长疫苗的免疫记忆提供了参考。
2015年03期 v.28 281-284页 [查看摘要][在线阅读][下载 430K] [下载次数：113 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 郭丽;李晓亮;吴雨虹;晏东铭;梁多宏;李新新;尹娇杨;
<正>人类红细胞血型由约20多种血型系统组成,ABO和Rh血型是与人类输血关系最为密切的两个血型系统。人类红细胞上的Rh血型系统包括5种不同的抗原:C、c、D、E、e。从理论上推断,有3对等位基因Cc、Dd、Ee控制着6个抗原,但实际上未发现单一的抗d血清,因而认为不存在d基因,在红细胞表面不表达d抗原。在5个抗原中,D抗原的抗原性最强。因此,通常将红细胞上含有D抗原的称为Rh阳性(+),
2015年03期 v.28 285页 [查看摘要][在线阅读][下载 272K] [下载次数：73 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]