- 佟鹏;魏志权;张伟;邵帅;王春燕;齐雪松;苟巧;
目的探讨过氧化氢酶(catalase,CAT)过表达对α粒子辐射致肺癌细胞模型BERP35T1内DNA氧化损伤水平和恶性表型的影响。方法构建p EGFP-CAT真核表达质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组表达质粒及空载体转染至BERP35T1细胞中,经G418筛选出具有抗性的细胞株。Real-time PCR和Western blot法检测BERP35T1细胞中CAT基因m RNA转录和CAT蛋白表达水平;免疫细胞化学法、MTT法、细胞划痕愈合试验和锚着独立生长试验分别检测CAT过表达对BERP35T1细胞DNA氧化损伤水平(8-OHd G水平)、增殖(细胞存活率)、迁移能力(细胞迁移距离)和锚着独立性(软琼脂克隆形成率)的影响。结果重组表达质粒p EGFP-CAT经PCR、酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,获得了CAT稳定表达的BERP35T1细胞株BERP35T1-CAT-7。空白对照BERP35T1、BERP35T1-p EGFP和BERP35T1-CAT-7细胞中CAT基因m RNA转录水平分别为0.90±0.23、1.00±0.12和2.91±0.41,CAT蛋白相对表达水平分别为0.97±0.11、1.00±0.00和5.72±1.28,8-OHd G表达水平分别为1.65×10-2、1.60×10-2和8.95×10-3,细胞存活率分别为(95.33±4.26)%、(100.00±8.29)%和(61.63±3.08)%,细胞迁移距离分别为(150.68±9.98)μm、(115.02±30.73)μm和(44.25±10.53)μm,细胞软琼脂克隆形成率分别为(2.50±0.02)‰、(2.10±0.02)‰和(0.70±0.02)‰。结论 CAT过表达可能通过降低DNA氧化损伤水平,抑制BERP35T1细胞的增殖、转移和锚着独立生长能力等恶性表型。
2015年10期 v.28 1011-1017页 [查看摘要][在线阅读][下载 432K] [下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王颖;徐炳政;张桂芳;张东杰;王欣卉;陈纯琦;
目的探讨酵母源金属硫蛋白(metallothionein,MT)在模拟胃肠环境中对铅离子的螯合作用,为酵母源MT促排铅功能的深入研究及相关促排铅产品的开发提供一定的理论参考与数据支持。方法以动物源金属硫蛋白(ZnMT)为对照,采用石墨炉原子吸收光谱法测定2种构型酵母源金属硫蛋白(MT-Ⅰ、MT-Ⅱ)在模拟胃肠环境中对铅离子的螯合作用,计算MT对铅离子螯合率,并分析螯合体系重金属离子的迁移与转化情况及酵母源MT在模拟胃肠环境中的稳定性。结果 MT在模拟胃肠环境中表现出显著的螯合铅离子能力,并呈现量效关系。在模拟胃环境中,MT-Ⅰ与MT-Ⅱ对铅离子的螯合率显著高于Zn-MT(P<0.05);胃蛋白酶对MT-Ⅰ和Zn-MT螯合铅离子效果具有一定的减弱作用(P<0.05),而对MT-Ⅱ影响不明显(P>0.05)。在模拟肠环境中,3种MT对铅离子的螯合效果差异有统计学意义(P<0.05),其螯合能力为Zn-MT>MT-Ⅰ>MT-Ⅱ,且显著高于同浓度MT在模拟胃环境中对铅离子的螯合率(P<0.05);胰蛋白酶对MT螯合铅离子效果影响较小(P>0.05)。MT在螯合铅离子过程中,可同时释放自身结合重金属元素,且自身重金属离子释放率显著高于铅离子螯合率(P<0.05);2种构型的酵母源MT在模拟肠环境中降解程度较弱,稳定性较好。结论 MT-Ⅰ与MT-Ⅱ在模拟胃肠环境中均能显著地螯合铅离子,并在12 h内能较好地抵抗模拟胃肠环境的消化,保持其螯合铅离子能力。
2015年10期 v.28 1018-1022+1027页 [查看摘要][在线阅读][下载 261K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 靳红亮;王述超;高菽蔓;张守峰;严妍;王东方;刘晔;扈荣良;
目的构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)BD06株磷蛋白(phosphoprotein,P)的重组人5型腺病毒,并进行鉴定。方法质粒p MD18-T-BD06P经双酶切后,获得完整的P蛋白基因,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pac Ad5CMVK-Np A,构建重组穿梭质粒pac Ad5CMV-BD06P,与骨架质粒pac Ad5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组,获得表达RABV P蛋白的重组人5型腺病毒r Ad5-BP。采用K覿ber法计算r Ad5-BP滴度,RT-PCR、Western blot、直接免疫荧光方法(direct immunofluorescence assay,d FA)检测P蛋白基因在HEK-293AD细胞的转录及表达水平。以107 TCID50r Ad5-BP肌肉注射免疫昆明小鼠,14 d后,经尾静脉采血,分离血清,IFA法检测抗RABVP蛋白抗体及其反应活性。结果经酶切及测序鉴定证明重组穿梭质粒pac Ad5CMV-P构建正确;重组腺病毒r Ad5-BP滴度可达108 TCID50/ml,能够介导P蛋白在HEK293AD细胞中的转录及表达,接种小鼠后可刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性。结论成功构建了RABVBD06株P蛋白重组人5型腺病毒,该病毒能够介导P蛋白在小鼠体内有效表达,刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性,为进一步研究RABV P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础。
2015年10期 v.28 1023-1027页 [查看摘要][在线阅读][下载 270K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 王少华;郑海锋;王宇涛;杨利军;杨涛;
目的表达纯化可溶性肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)蛋白,并测定其生物学活性。方法利用E.coli中表达C-端带有6×His标签的可溶性TRAIL蛋白,并优化诱导时间(4、6和8 h)和诱导剂IPTG的浓度(0.06、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L)。表达产物经Ni亲和层析和离子交换层析纯化后,采用MTT法测定不同浓度TRAIL(终浓度分别为100、200、400 ng/ml)的活性,并检测亲和层析过程中两种洗脱方式(洗脱液4℃留柱过夜后进行洗脱和洗脱液进柱后直接收集流出液)及纯化过程中两次透析的时间(均为24和48 h)对TRAIL活性的影响。结果最佳诱导时间为6 h,最佳IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L。表达产物的表达量占菌体总蛋白的20%,相对分子质量为20 000,可与兔抗人TRAIL单克隆抗体发生特异性结合。TRAIL终浓度为100、200和400 ng/ml的实验组的抑制率分别约为36%、53%和73%。亲和层析的两种洗脱方式的TRAIL活性差异无统计学意义(P>0.05),透析48 h比透析24 h获得的TRAIL活性显著降低(P<0.05)。结论 TRAIL蛋白成功在E.coli中表达,具有抑制肿瘤细胞生长的作用,优化后的TRAIL诱导条件和纯化方法可进一步大量生产高TRAIL蛋白的活性,满足了TRAIL的基础及临床相关研究的要求。
2015年10期 v.28 1028-1032页 [查看摘要][在线阅读][下载 294K] [下载次数：90 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 张雅婷;潘勇兵;张银川;张坤明;任彬;宋桂芝;桂芳;闭兰;
目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。
2015年10期 v.28 1048-1052页 [查看摘要][在线阅读][下载 186K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨云凯;马昱;孙玉杰;马晓宇;安焕宇;
目的建立测定注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)成品中干扰素β1b(interferonβ1b,IFNβ1b)含量的反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RPHPLC)。方法采用色谱柱ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),以含95%水、5%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相A液,以含5%水、95%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相B液,流速为1.5 ml/min,梯度洗脱10 min(A液从70%~30%),检测波长为214 nm,柱温为35℃,进样量为20μl。对该方法的适用性、线性、精密度、重复性和准确度进行验证。用建立的方法检测3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。结果建立的方法系统适应性良好;IFNβ1b在20~100μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系,r2=0.998;供试品溶液连续6次进样,峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.97%;6份同一批供试品IFNβ1b含量的平均值为302.83μg/ml,RSD为0.99%;40、60和80μg/ml的IFNβ1b加标平均回收率分别为93.1%、94.18%和93.67%,RSD均<2%。3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量分别为389.8、364.5和304.6μg/ml。结论建立的RP-HPLC法操作简便,精密度、重复性、准确度好,可用于测定注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。
2015年10期 v.28 1053-1056页 [查看摘要][在线阅读][下载 174K] [下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 刘月萍;范锋锋;周海飞;许博;王欣茹;金鑫;赵志强;祝秉东;谢贵林;谭小梅;
目的建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量的ELISA方法,并进行验证。方法以美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)测定Vi抗体的ELISA方法为主要参考,对包被抗原、不同吸附力酶标板、抗原包被浓度、样品反应条件、显色时间进行优化,建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量的ELISA方法,并对建立的方法进行特异性、线性、准确性、精密度、最低检测限验证。结果优化的ELISA法为:以伤寒Vi多糖作为包被抗原,costar92592型酶标板作为检测酶标板,2.0μg/ml为抗原包被浓度,20~25℃过夜为样品的反应条件,在40~80 min内(A405值在1.8~2.5之间)终止显色。质控血清经不同含量多糖吸收后,抗体含量与多糖浓度具有明显的浓度依赖关系,多糖抑制率最高可达92%;血清稀释度与抗体含量存在负相关的线性关系,R2=0.999;本试验检测的质控血清抗体浓度为76.80 EU/ml,变异系数(CV)=8.55%,与美国NIH检测的数据(75 EU/ml,CV≤15%)一致性良好;该方法重复性(CV≤15%)及中间精密度(CV≤20%)均符合要求;最低检测限为0.78 EU/ml。结论建立了人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量ELISA检测方法,该方法特异性、线性、准确性、精密度良好,可快速、准确地检测人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量。
2015年10期 v.28 1057-1062页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] [下载次数：220 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王晶晶;廖芸;王丽春;李琦涵;刘龙丁;程晨;夏龙辉;尹晓晓;张莹;
目的对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)的灭活工艺进行验证。方法取3批次经甲醛灭活的EV71灭活病毒收获液样品,分别连续盲传4代,并设病毒对照盲传4代。观察每代次样品的细胞病变情况,采用微量滴定法检测病毒感染性滴度,ELISA法检测EV71特异抗原含量,实时定量PCR法检测病毒核酸水平及病毒负链产生情况。结果 3批灭活的疫苗病毒收获液样品经4次盲传后,各代次均未出现明显的细胞病变,经微量滴定法均未检测到EV71感染性滴度。灭活的病毒收获液盲传至第2代时,病毒负链检测已为阴性;至第3代时,EV71抗原检测为阴性;至第4代时,病毒核酸检测为阴性。病毒对照经盲传4代后,各代次均出现明显细胞病变;自第2代开始,感染性滴度维持在106~107 CCID50/ml,抗原含量为200~370 U/ml,且均可检测出明显的病毒核酸及病毒负链增殖。结论通过经典的"细胞上盲传3代"的检测方法,并结合实时定量RT-PCR对病毒核酸和负链进行检测,证实经甲醛灭活的EV71灭活疫苗样品已完全灭活。
2015年10期 v.28 1063-1066+1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 210K] [下载次数：400 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 卢勇;贾继宗;唐静;叶祥忠;
目的比较PCR法、酶法和DNA荧光染色法3种支原体检测方法的灵敏度。方法支原体阳性的BSR细胞培养上清10倍系列稀释后(10-1~10-8),接种至支原体阴性的Vero细胞上,盲传培养5代,每代每个稀释度的样品分别采用PCR法、酶法和DNA荧光染色法检测支原体,并以支原体阴性的Vero细胞作为阴性对照。结果 10倍系列稀释的阳性样品盲传1代,PCR法能检测到10-4,酶法和DNA荧光染色法能检测到10-3;盲传2代,3种方法均能检测到10-4;盲传3代后,3种方法均能检测到10-5,且检测的支原体滴度不随盲传代次的增加而增加。结论待检样本盲传3代后的支原体用3种方法均可检出,检测灵敏度一致。PCR法与酶法检测支原体准确、快速、简便易行,可作为DNA荧光染色法(支原体检测的金标准)的补充手段。
2015年10期 v.28 1067-1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 309K] [下载次数：619 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 刘爱萍;胡浩;李献林;孔素娟;王晶;袁菲;王欣茹;刘方蕾;吴兵;赵志强;谢贵林;
目的微孔板法检测肺炎球菌多糖中甲基戊糖含量,并对该方法进行验证。方法将常规甲基戊糖测定法应用于微孔板,并优化盐酸半胱氨酸浓度。对建立的方法进行线性、精密度及准确度的验证。用建立的方法检测肺炎球菌多糖样品中甲基戊糖含量及多糖衍生物的分子量分布。结果最佳的盐酸半胱氨酸浓度为15 mg/ml。标准品L-鼠李糖在5~30μg/ml范围内,其浓度与(A396-A430)值呈良好的线性关系,R2>0.999;批内及批间CV值分别为0.9%~1.1%及2.2%~3.2%;加入2.5、5、10μg/ml L-鼠李糖的6B型原糖及多糖衍生物中的甲基戊糖含量的回收率为91.73%~100.70%。微孔板法及常规方法测定的肺炎球菌多糖中甲基戊糖含量无明显差异(P>0.05),微孔板法测定多糖分子量分布与常规方法有较好的一致性。结论微孔板法可有效、准确、稳定地检测肺炎荚膜多糖及其衍生物中甲基戊糖含量,该方法灵敏度高,操作简便快捷,节约样品、试剂等材料,适用于疫苗生产过程中的质量控制。
2015年10期 v.28 1072-1076页 [查看摘要][在线阅读][下载 193K] [下载次数：194 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张慧娟;向港;李若竹;吴泽旋;于玉根;
目的运用实验设计(design of experiments,DOE)方法优化表达抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体细胞用培养基,以提高抗体表达量。方法利用Minitab软件进行DOE,考察不同基础培养基、补料培养基对工程细胞株(CHO-DG44)的细胞密度和抗HER2单克隆抗体表达的影响。结果经过DOE方法优化,在最优培养基组合中工程细胞株的最高活细胞密度(peak viable cell density,PVCD)达296×105个/ml,抗体表达量最高达2.07 g/L,比DOE优化之前最高试验组表达量(1.20 g/L)提高了72%,所表达抗体的质量与原研对照品非常一致。结论得到1组较优的基础培养基与补料培养基配比与组合,该培养基组合提高了细胞密度与抗体表达量,且其适合抗HER2单克隆抗体生产使用,表明DOE是一种短期快速提高抗体表达行之有效的方法。
2015年10期 v.28 1077-1083页 [查看摘要][在线阅读][下载 347K] [下载次数：334 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 饶桂荣;石燕飞;黄彬;张换敬;范谕敏;莫国玉;陈光明;王洪敏;杨富强;
目的提取、纯化靶向治疗肺癌的质粒TV-BIKDD,并进行质量检定。方法采用碱裂解法对工程菌DH5α/TVBIKDD菌体进行质粒初提,通过两步整体柱层析(离子柱层析和疏水柱层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、DNA超螺旋比例;用该方法连续纯化3批以超螺旋质粒DNA为样品的溶液制剂,对纯化后的质粒进行质量检定。结果质粒初提液经离子柱层析纯化后,去除了大量的RNA和蛋白质,再经过疏水柱层析纯化,最终获得的质粒DNA超螺旋比例为95.21%以上,质粒总回收率为78%。纯化后的3批溶液制剂全面质量检定结果均符合美国FDA标准以及我国人基因治疗用产品的技术指导原则规定。结论建立了稳定的TV-BIKDD质粒的纯化工艺,为进一步制备临床药用级样品的规模化工艺研究奠定了基础。
2015年10期 v.28 1084-1088页 [查看摘要][在线阅读][下载 244K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 谢英林;周庆玲;王文军;岳振奇;韩云飞;汪一名;李春艳;李杨;郑超;李光谱;
目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。
2015年10期 v.28 1089-1091+1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 138K] [下载次数：184 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 周兰贞;刘永娣;戴美兰;容伟华;王红冰;田华;张剑平;
目的应用细胞荧光转化灶(fluorescence focus units assay,FFU)法检测狂犬病病毒滴度。方法将狂犬病病毒稀释后接种BSR细胞,培养22~24 h,用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,计数病毒感染细胞的荧光灶数,计算病毒滴度。采用乳鼠半数致死量(median lethal dose,LD50)法和建立的方法分别测定14批狂犬病病毒滴度,分析两者间的相关性;取同一份病毒液,于不同时间点检测3次,每个时间点重复检测6次,验证方法的重复性;取3份滴度不同的病毒液,由2个操作者在不同时间重复测定3次,验证方法的中间精密性;将同一份病毒液按2倍梯度稀释,共9个稀释度,分别检测病毒滴度,重复测定3次,确定该方法的线性范围。应用建立的方法检测38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度。结果乳鼠LD50法测定14批狂犬病病毒的-Lg LD50值范围为4.20~8.19,FFU法Lg FFU值范围为3.76~7.69,两种方法检测结果趋势相同,线性回归相关系数R-Sq(调整)=96.1%,存在良好的正相关性;同一个时间点检测6次及不同时间点检测3次的CV值均小于2.00%;两个操作者在不同时间重复测定3次的CV值均小于8.00%,两个操作者之间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05);样品浓度与Lg FFU呈良好的线性关系,R-Sq(调整)=99.3%,线性范围为2.26~6.12。38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度平均Lg FFU在3.63~7.69之间,SD值在0.021~0.57之间,CV值小于10.00%。结论建立的细胞FFU法准确性、重复性、中间精密度好,该方法可用于检测狂犬病病毒滴度。
2015年10期 v.28 1092-1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 203K] [下载次数：307 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]