- 王丽婵;谭亚军;卫辰;张华捷;马霄;
目的 对b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）D蛋白（protein D,PD）作为载体的C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖（group C meningococcal polysaccharide,GCMP）-蛋白结合物进行免疫效果评价，以确定PD作为GCMP蛋白载体的可行性。方法 采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸（CDAP）活化法，将重组PD、破伤风类毒素（tetanus toxin,TT）分别与GCMP结合制备结合物；将GCMP及结合物分别经腹部皮下免疫雌性BALB/c小鼠，分为GCMP、GCMP-PD、PD、GCMP-TT、TT及阴性对照（生理盐水）组，每组12只，共免疫3次，分别于每次加强免疫前及末次免疫后7 d，经眼眶采血，分离血清，用于抗体水平检测及血清杀菌力试验（serum bactericidal assay,SBA）；同时在末次免疫后7 d取脾脏，进行细胞免疫水平检测。结果 蛋白与GCMP结合后能增强抗-GCMP抗体IgG水平，第3次免疫后，与单独GCMP组相比，GCMP-PD和GCMP-TT组小鼠血清抗-GCMP IgG水平均显著升高（F分别为5.294、14.917,P均<0.05），且产生免疫记忆，诱导IgG1产生，但GCMP-PD组低于GCMP-TT组（F=5.828,P <0.05）;CMP-PD、PD组小鼠血清抗-PD IgG抗体水平各次免疫后均显著增长，第3次免疫后，GCMP-PD组抗-PD IgG抗体水平显著高于PD组（F=15.426,P <0.01），而GCMP-TT组低于TT组（F=211.207,P <0.001）。SBA结果显示，GCMP-PD组杀菌抗体滴度高于GCMP组（F=11.797,P <0.05），但低于GCMP-TT组（F=8.688,P <0.05）。流式细胞术结果显示，GCMP-PD组Th1、Th2细胞亚群比值与GCMP及GCMP-TT组相比，差异均无统计学意义（F分别为0.073、3.021,P均> 0.05）。结论 重组PD与GCMP结合后，既能增强多糖疫原性，提高体液免疫反应能力，也能激发细胞免疫反应，同时免疫后血清杀菌效果显著，提示PD具备作为GCMP蛋白载体的可行性。
2024年10期 v.37 1161-1166页 [查看摘要][在线阅读][下载 849K] [下载次数：153 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：18 ] - 杨习曼;栗璐芳;张芳;卢先锋;刘建荣;秦琴;
目的 观察缺氧对支持细胞的影响，探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）/PI3K/Akt通路对缺氧条件下大鼠睾丸支持细胞凋亡的作用机制。方法 分离、培养大鼠睾丸支持细胞，将细胞分为4组：C（正常培养不做任何处理）、V（缺氧培养48 h）、H（感染腺病毒敲低HIF-1α+缺氧培养48 h）、NC（感染空病毒载体+缺氧培养48 h）组，Western blot法检测HIF-1α、VEGF、p-Akt、Akt、p-p70S6K、p70S6K、Bax、Bcl-2蛋白的表达，免疫荧光法检测Bax蛋白在细胞中的表达和定位，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 Western blot结果显示，与C、H组比较，V和NC组HIF-1α、VEGF、p-Akt、p-p70S6K、Bax蛋白的表达明显升高（F分别为11.71、20.34、10.28、6.096和18.55,P均<0.05）,Bcl-2蛋白的表达明显降低（F=12.92,P <0.05）;4组Akt、p70S6K蛋白的表达差异均无统计学意义（F分别为0.572 7和0.156 9,P均> 0.05）。免疫荧光结果显示，Bax主要在胞质中表达，与C、H组比较，V和NC组Bax蛋白的表达明显升高（F=64.83,P <0.05）。流式细胞术结果显示，与C、H组比较，V和NC组凋亡率明显升高（F=9.649,P <0.05）。结论 缺氧导致支持细胞凋亡可能是由于HIF-1α表达升高激活下游VEGF/PI3K/Akt信号通路所致。
2024年10期 v.37 1167-1172页 [查看摘要][在线阅读][下载 995K] [下载次数：373 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：8 ] - 庞嘉辉;郝鹏亮;郭长福;孟胜利;郭靖;明平刚;
目的 探讨国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质对Omicron株新型冠状病毒（SARS-CoV-2）灭活疫苗的分离纯化效果，为促进层析介质的国产替代提供数据支持。方法 选取3批SARS-CoV-2 Omicron株灭活病毒浓缩液，分别使用国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质在相同实验条件下进行纯化，收集病毒峰并检测收集组分中的抗原含量、蛋白质含量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞宿主蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量等相关质量参数，并计算比活性和抗原回收率。结果 在采用10%柱体积和30 cm/h线性流速对两种填料进行上样纯化之后，所得收集组分的平均抗原回收率分别为55.29%和53.31%，差异无统计学意义（t=1.44,P> 0.05），比活性、Vero细胞DNA残留量及Vero细胞宿主蛋白残留量间差异也无统计学意义（t分别为-0.25、1.31和0.66,P均> 0.05），仅牛血清白蛋白残留量差异有统计学意义（t=-2.73,P <0.05）。结论 采用国产与进口琼脂糖凝胶过滤层析介质纯化SARS-CoV-2 Omicron株灭活病毒浓缩液，所得收集组分各项质量参数间除牛血清白蛋白残留量外均无显著差异，因此，在纯化Omicron株SARS-CoV-2灭活疫苗时，可考虑使用该国产层析介质替代进口层析介质。
2024年10期 v.37 1173-1178页 [查看摘要][在线阅读][下载 939K] [下载次数：399 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：21 ] - 刘文婧;郭乐;王顺娟;冯琳;辛明远;马敬唯;高申涵;彭司南;汤锋;李润乐;胥瑾;
目的 基于纳米抗体文库筛选针对幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）尿素酶的纳米抗体，并对其结构及结合位点进行分析，鉴定其对尿素酶活性的影响。方法 通过天然羊驼噬菌体抗体展示文库，以尿素酶B亚基为靶抗原，经4轮淘选及阳性克隆筛选，获得针对H.pylori尿素酶的纳米抗体。通过结构预测软件对该纳米抗体结构及其与尿素酶空间结合区域进行分析，并判断尿素酶纳米抗体对尿素酶活性的影响。结果 共获得3株抗H.pylori尿素酶B亚基纳米抗体。3株纳米抗体序列同源性为78.43%，且可变区均为疏水性氨基酸，含较多β折叠和Loop区域；在3D模型相同位点上均可形成更加紧密且范围较大的接触，与尿素酶B的301～312、371～385、440～460、550～570等位点形成接触；与尿素酶B结合时均能形成空间位阻，干扰尿素酶A与B亚基二聚体的形成，从而影响尿素酶的功能。结论 获得的高亲和力抗尿素酶纳米抗体对尿素酶活性具有抑制作用，为后续制备H.pylori尿素酶诊断抗体及寻找新治疗靶点提供了实验依据。
2024年10期 v.37 1179-1184页 [查看摘要][在线阅读][下载 1169K] [下载次数：429 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：6 ]
- 赵鹏;李艳梅;邱剑飞;潘朝兰;杨珏;郝小江;
目的 探讨Cynanoside H对三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）MDA-MB-231细胞增殖和转移的影响及其作用机制，为治疗TNBC药物的开发提供实验依据。方法 将MDA-MB-231细胞随机分为对照组（不加Cynanoside H）和不同浓度Cynanoside H(2.5、5、10μmol/L)处理组。采用MTT法、平板克隆形成法检测Cynanoside H对MDA-MB-231细胞增殖的影响；流式细胞术检测Cynanoside H对MDA-MB-231细胞周期的影响；划痕-愈伤试验、Transwell迁移及侵袭试验检测Cynanoside H对MDA-MB-231细胞转移的影响；Western blot检测Cynanoside H对MDAMB-231细胞中周期（c-Myc、CDK1、CDK2及cyclin E1）、转移（E-cadherin、Vimentin及β-catenin）及PDGFRB/JAK2/STAT3通路相关蛋白（PDGFRB、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3）表达的影响。结果 2.5、5、10μmol/L Cynanoside H剂量组的细胞活力（t分别为4.598、19.77和53.43,P均<0.05）、细胞生长（36 h:t分别为8.256、11.57和12.16,P均<0.05;48 h:t分别为10.49、22.49和19.63,P均<0.01;72 h:t分别为50.20、28.84和15.83,P均<0.01;96 h:t分别为11.18、18.35和20.92,P均<0.01）及细胞克隆形成（t分别为4.618、9.821和12.14,P均<0.05）均明显低于对照组。与对照组相比，Cynanoside H各剂量组以浓度依赖性方式增加了S期的细胞比例（48 h:t分别为6.316、8.156和14.11,P均<0.05;72 h:t分别为7.231、15.36和25.16,P均<0.05），且下调了c-Myc(5和10μmol/L:t分别为10.39和12.18,P <0.05和<0.01)、CDK1(t分别为3.777、5.069和6.974,P均<0.05)、CDK2(5和10μmol/L:t分别为12.72和19.43,P均<0.01)及cyclin E1(5和10μmol/L:t分别为3.813和15.23,P均<0.01)在蛋白水平的表达。Cynanoside H各剂量组与对照组相比，明显抑制了MDA-MB-231细胞划痕愈合（48 h:t分别为6.969、56.16和27.73,P均<0.05;72 h:t分别为8.619、22.12和32.15,P均<0.05）、Trswell迁移（t分别为9.817、14.74和19.39,P均<0.01）及侵袭（t分别为5.614、13.85和14.22,P均<0.01），且上调了E-cadherin在蛋白水平的表达（10μmol/L:t=11.79,P <0.01），下调了Vimentin(5和10μmol/L:t分别为12.05和13.02,P均<0.01)和β-catenin(5和10μmol/L:t分别为4.516和9.305,P均<0.01)在蛋白水平的表达，显著下调了PDGFRB蛋白表达（5和10μmol/L:t分别为7.083和18.87,P均<0.01），并抑制了p-JAK2(t分别为4.050、10.95和11.05,P均<0.05)和p-STAT3(5和10μmol/L:t分别为15.25和25.89,P均<0.01)蛋白表达水平，对JAK2和STAT3总蛋白的表达无影响。结论 Cynanoside H通过诱导S期细胞周期阻滞而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，逆转上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）而抑制MDA-MB-231细胞的转移，且可能通过下调PDGFRB/JAK2/STAT3信号通路进而抑制MDA-MB-231细胞的增殖及转移。
2024年10期 v.37 1190-1199页 [查看摘要][在线阅读][下载 1235K] [下载次数：188 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ]
- 王玢;杨林鹏;陈卓涛;周晖国;邵志伟;马素娟;杨千苇;李薇;杨俊杰;
目的 比较分步和循环2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果，以期为今后汉逊酵母细胞工业化规模生产破碎方式的选择提供实验依据。方法 采用分步和循环2种高压匀浆破碎方式对3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液进行破碎，取破碎前后样品，置光学显微镜下观察细胞形态，检测宿主蛋白含量、细胞破碎率、蛋白释出度、释出蛋白粒径分布等指标，并进行比较。结果 分步和循环破碎2种高压匀浆破碎方式破碎3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液后，完整细胞数量减少，细胞碎片增多，但细胞形态未见明显差异；宿主蛋白含量（平均灰度值分别为115.259和109.125）、细胞破碎率（均值分别为60.29%和58.96%）、蛋白释出度（均值分别为39.55%和37.28%）、释出蛋白粒径分布（分步方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在90.41和525.07 nm处,分别占样品蛋白含量的31.37%和68.63%；循环方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在109.11和547.37 nm处，分别占样品蛋白含量的29.93%和70.07%）的差异均无统计学意义（F分别为1.054、1.159、4.245、8.875,t分别为1.036 0、0.504 1、0.605 0、0.139 7,P均<0.05）。结论 循环和分步2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果相当，但循环破碎方式更简便，且可避免污染风险，更适用于工业化规模生产汉逊酵母细胞的破碎。
2024年10期 v.37 1214-1217+1224页 [查看摘要][在线阅读][下载 889K] [下载次数：278 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：13 ] - 孙博;何小曼;江涛;谷铁军;姜巍;姜恬馨;李吉;王梦舒;刘大维;毕楠;
目的 建立小鼠血清中百日咳毒素（pertussis toxin,PT）、丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）及百日咳黏附素（pertussis adhesin,PRN）抗体间接ELISA定量检测方法，并进行验证及初步应用，为百日咳疫苗生产工艺的优化提供参考。方法 分别用PT、FHA及PRN抗原包被酶标板，加入百日咳抗小鼠血清标准品及待测小鼠血清，以HRP标记的山羊抗鼠IgG作为酶标二抗，通过TMB显色的指示程度定量检测小鼠血清中PT、FHA、PRN抗体含量。对建立的间接ELISA检测方法进行专属性、线性范围、准确性、精密性进行验证。采用建立的方法对百日咳疫苗及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清进行检测。结果 采用PT、FHA、PRN抗体ELISA方法检测百日咳抗小鼠血清标准品及待测样品的结果为阳性，其余样本检测结果均为阴性。PT抗体ELISA检测方法的线性范围为0.005 3～0.17 U/mL，回收率为90.91%～104.77%，重复性验证RSD为6.31%，人员间RSD为6.40%;FHA抗体ELISA检测方法的线性范围为0.022 3～1.43 U/mL，回收率为95.84%～102.18%，重复性验证RSD为9.02%，人员间RSD为5.79%;PRN抗体ELISA检测方法的线性范围为0.009 4～0.3 U/mL，回收率为86.27%～100.22%，重复性验证RSD为6.94%，人员间RSD为8.90%。采用建立的方法检测百日咳疫苗样品及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清，6组样品PT抗体水平明显高于内部参比品，FHA、PRN抗体水平与内部参比品相当。结论 建立的各抗体ELISA检测方法专属性强，线性相关性良好（R2> 0.99），准确性高，精密性良好，可用于小鼠血清中百日咳（PT、FHA、PRN）抗体的定量检测，为百日咳疫苗生产工艺的优化提供了参考。
2024年10期 v.37 1218-1224页 [查看摘要][在线阅读][下载 844K] [下载次数：408 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：28 ] - 代航;毛群颖;胡春霞;刘建阳;张佳璐;李玉薇;刘明琛;李娜;贺倩;王泽鋆;梁争论;李长贵;徐苗;
目的 依据全球最新的分析方法质量源于设计（Analysis Quality by Design,AQbD）和全生命周期理念，建立适用于新型冠状病毒Omicrion XBB.1.5变异株的临床中和抗体和流行病学调查用中和抗体检测方法。方法 在已建立的新型冠状病毒原型株中和抗体（CPE法）检测方法的基础上，针对XBB.1.5变异株变更对中和抗体检测方法可能引入的影响因素进行风险评估，对主要风险因素进行条件优化，获得适应XBB.1.5变异株的检测方法，经方法验证明确该方法各项性能指标，并证明方法可满足分析目标概要（Analysis Target Profile,ATP）。结果 由XBB.1.5变异株变更引入的主要风险因素为检测细胞、培养基种类和结果判定时间；通过对实验条件优化，最终确定将Vero-E6细胞（DMEM培养基）作为XBB.1.5变异株的最佳培养条件，第5天作为最佳观察时间；经验证得到方法相对准确度和中间精密度的平均相对偏倚为-9.2%～2.9%、几何变异系数（geometric coefficient of variation,GCV）为33.2%～47.1%，满足方法预设ATP，方法误判率低于1.6%。结论 依据AQbD和全生命周期的研究理念建立了针对新型冠状病毒XBB.1.5变异株的中和抗体检测方法，经验证该方法满足预设ATP，可用于临床中和抗体和流行病学调查用中和抗体检测。
2024年10期 v.37 1225-1229+1238页 [查看摘要][在线阅读][下载 868K] [下载次数：225 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：28 ] - 邹剑;杨蕾;李茂光;叶强;焦旭雯;梁蔚阳;郭中平;马晶;姚宇峰;李炎;
目的 建立尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（size exclusion chromatography-multiangle laser-light scattering,SEC-MALLS）联用测定脑膜炎球菌多糖及多糖蛋白结合物分子量的方法，并进行验证及初步应用，以期进一步提高该品种质量控制水平。方法 建立SEC-MALLS联用方法检测脑膜炎球菌多糖及多糖蛋白结合物分子量，色谱条件：流动相为0.9%氯化钠溶液，色谱分离柱为Shodex OHpak LB-806 HQ(300 mm×8.0 mm,13μm)，流速为0.5 mL/min，柱温为35℃。对方法的系统适用性、准确性、精密性、耐用性进行验证，并用该方法检测不同厂家来源的样品，同时与现行药典质量标准方法进行相关性分析。结果 普鲁兰糖标准品除STD P-100以外，STD P-50 STD P-800重均分子量（Mw）实测值与标示值相对误差和精密度小于5.0%，可作为系统适应性样品；重复性、中间精密度RSD均不大于5.0%。多糖及多糖蛋白结合物在配制完成48 h内稳定性良好。A、C、Y、W135群多糖平均Mw分别为257.5、377.3、399.7、305.5 kDa;A、C群多糖蛋白结合物分别为6 438、23 360 kDa。71批多糖样品中有5批次A、C群结果超趋势，其余批次批内和批间差异均在均值±3 SD的范围以内。SEC-MALLS法与现行药典质量标准方法测定结果除Y群多糖分配系数（K_D）与Mw呈一定的负相关性外，两种方法在其余多糖及多糖蛋白结合物中相关性并不显著。结论 SEC-MALLS方法能直接测定脑膜炎球菌疫苗多糖及多糖蛋白结合物分子量，具有操作简单、快速、准确、能一定程度反映分子结构信息等优点，有利于提升该关键质量参数的质量控制水平。
2024年10期 v.37 1230-1238页 [查看摘要][在线阅读][下载 1101K] [下载次数：387 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：17 ] - 段艳;李文东;李珉;何欢;李潇;
目的 建立应用生物分析仪（Agilent 2100）检测新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域（receptor-binding domain,RBD）二聚体纯度的方法，并对其进行验证。方法 对新型冠状病毒重组蛋白疫苗进行解析附后，超滤浓缩蛋白，采用生物分析仪（Agilent 2100）检测完全及非完全变性（二硫键保留）蛋白的纯度；对建立的方法进行系统适用性、专属性、重复性、中间精密度和准确度验证后，用其检测厂家A 4批样品。结果 系统适用性验证中，8个峰均可清晰区分基线；空白溶剂在目标成分出峰位置无干扰，专属性良好；在非完全和完全变性条件下，2名实验员12次重复检测结果的RSD均小于1%，重复性和中间精密度良好；3种不同蛋白浓度（50%、80%和100%）主峰（1+2）及主峰面积占比的RSD分别为0.68%和0.31%，准确度良好,其中，10%蛋白浓度样品结果不稳定；4批样品RBD二聚体纯度分别为70.5%、70.2%、73.2%和69.6%。结论 建立的方法专属性、精密度、准确度良好，可用于重组蛋白疫苗中蛋白纯度的检测。
2024年10期 v.37 1239-1244+1250页 [查看摘要][在线阅读][下载 871K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：9 ] - 李甜甜;王鸣人;史卓维;赵沁;王灿;邵泓;
目的 建立基于实验设计（Design of Experiment,DOE）的SARS-CoV-2中和抗体相对活性检测方法，并进行验证，以期为SARS-CoV-2中和抗体的研发和质量评价提供可靠的检测方法。方法 采用SARS-CoV-2变异株假病毒建立用于评价SARS-CoV-2中和抗体相对活性的方法，通过DOE优化细胞密度[（3～5）×10~5个/mL]、假病毒滴度（3 750～6 250 TCID_(50)/mL）、抗体与假病毒中和时间（0.5～1.5 h）、抗体假病毒复合物与细胞作用时间（48～96 h），并验证方法的专属性、线性范围、准确性、精密性。采用优化的方法检测2批SARS-CoV-2中和抗体的相对活性。结果 确定最佳细胞密度为4×10~5个/mL，假病毒滴度为6 250 TCID_(50)/mL，抗体与假病毒中和时间为1.5 h，抗体假病毒复合物与细胞作用时间为96 h。仅SARS-CoV-2中和抗体呈典型量效曲线，抗VEGF单克隆抗体和样品稀释液均未呈现量效曲线；SARS-CoV-2中和抗体理论效价在50%～200%范围内与检测值呈良好的线性关系，线性方程为y=1.034 2 x-0.013,r=0.958 8;50%、71%、100%、141%和200%相对效价水平样品3次检测结果均值的相对偏倚为-6.2%～7.3%，几何变异系数（geometric coefficient of variation,GCV）为3.2%～16.9%。2批SARS-CoV-2中和抗体相对活性分别为91%和118%。结论 建立的方法具有良好的专属性、准确性及精密性，可用于SARS-CoV-2中和抗体相对活性的检测。
2024年10期 v.37 1245-1250页 [查看摘要][在线阅读][下载 844K] [下载次数：196 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：8 ] - 黄天威;苏文瀚;彭涛;许煜华;陈忠正;
目的 建立杆状病毒（baculovirus,BV）微滴式数字PCR检测方法，并对其退火温度、引物及探针浓度优化后，进行方法验证。方法 根据GP64基因保守序列特征，设计特异性引物及TaqMan探针，建立靶向BV的微滴式数字PCR检测方法，优化体系的退火温度、引物及探针浓度，并进行方法的特异性、重复性、灵敏度、线性验证；采用建立的微滴数字式PCR法检测GMP中试生产车间24份样本，并与蚀斑法检测结果继续比较。结果 建立了靶向BV的微滴式数字PCR检测方法，优化后的退火温度、引物及探针浓度分别为58.0℃、400 nmol/L、200 nmol/L。仅以BV核酸为模板的反应中检测到阳性液滴，方法特异性良好；批内重复性CV在2.78%～7.45%之间，批间重复性CV在2.28%～7.05%之间，均<10%，方法重复性良好；最低检测限为3.06 copies/μL，约为常规PCR的100倍，方法灵敏度高；24份样本检测结果与蚀斑法接近，相关系数（r）为0.913。结论 成功建立了针对BV的优化后的微滴式数字PCR检测方法，该方法具有良好的特异性、重复性、灵敏度、快捷性，可用于生产中BV的快速检测。
2024年10期 v.37 1251-1256+1262页 [查看摘要][在线阅读][下载 1040K] [下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：10 ] - 金育;何春艳;罗忠瑞;张玉芳;马云飞;刘野;
目的 建立基于磁珠分选及多肽自组装介导的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗体荧光定量检测方法，并进行验证。方法 通过点击化学反应将磁珠和SARS-CoV-2核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白特异性结合，采用Western blot和BCA法检测其结合效果。用N蛋白标记的磁珠作为包被抗原，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）标记的驴抗人IgG作为酶标抗体，结合可组装的多肽及硫磺素-T(thioflavine-T,ThT)发光系统，建立SARS-CoV-2抗体定量检测方法，并验证其特异性、线性范围、最低检测限（limit of detection,LOD）、精密性和耐用性。采用建立的方法和市售ELISA试剂盒分别检测8份已知背景的血清样本，并计算二者的一致性。结果 大部分SARS-CoV-2 N蛋白均已稳定结合至磁珠上。建立的方法可特异性检测阳性血清样本；SARS-CoV-2抗体IgG标准品浓度在2.5～80 ng/mL范围内，与荧光值呈良好的线性关系，线性方程为y=182.11 x+5 095.5,R~2=0.99;LOD为2.5 ng/mL；批内变异系数（coefficient of variation,CV）在3.9%～10.6%之间，批间CV在6.0%～13.8%之间；耐用性CV在1.3%～6.2%之间。建立的方法与市售ELISA试剂盒定量检测结果具有较高的一致性（R~2=0.99,P <0.000 1）。结论 本研究建立的基于磁珠分选及多肽自组装介导的荧光定量检测方法具有良好的特异性、精密性和耐用性，可用于SARS-CoV-2抗体水平的定量检测。
2024年10期 v.37 1257-1262页 [查看摘要][在线阅读][下载 882K] [下载次数：188 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：7 ] - 王魁;殷吉祥;程之铭;郭冰峰;郝一楠;潘若文;
目的 建立重组E.coli宿主中质粒DNA(pDNA)拷贝数的qPCR检测方法，并进行验证，以期为mRNA疫苗研发提供可靠的检测方法。方法 根据E.coli Top10基因组DNA序列设计用于qPCR扩增的引物及探针，并优化引物浓度。提取重组E.coli/pUC57-HA的全DNA（宿主DNA+pDNA），以其为模板，建立pDNA拷贝数的qPCR检测方法，并验证方法的线性范围、特异性及重复性。将重组E.coli/pUC57-HA于37℃培养24 h，每2 h取样，采用建立的方法检测pDNA拷贝数。结果 确定最佳引物（F/R）浓度均为0.5μmol/L。重组E.coli/pUC57-HA全DNA在10~1～10~5倍稀释范围内，与Ct呈良好的线性关系，R~2均=1.00;E.coli/pUC57-HA及E.coli Top10的扩增结果为阳性，阴性对照（ddH_2O）未见扩增曲线；3次重复检测重组E.coli/pUC57-HA的pDNA拷贝数CV <5%。E.coli/pUC57-HA培养0～6 h期间pDNA拷贝数呈平稳趋势，6～12 h期间呈下降趋势，12～16 h期间呈增长趋势，16～24 h又趋于平稳。结论 建立的qPCR法具有良好的特异性及重复性，可用于重组E.coli宿主中pDNA拷贝数的检测，有效监测菌株培养过程中pDNA含量变化。
2024年10期 v.37 1263-1267+1274页 [查看摘要][在线阅读][下载 908K] [下载次数：336 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：17 ]