- 聂玲玲;李佳铱;修朋程;刘朋飞;江宁;徐灵杰;黄维金;张黎;
目的 建立基于多重国产流式荧光平台的九价人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）疫苗人血清IgG抗体检测方法，并对方法进行优化及验证，以替代Luminex技术，降低检测成本。方法 将筛选到的9种国产磁性荧光微球与9种Luminex荧光微球分别偶联HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58这9种抗原，偶联抗原的微球在同一孔中与血清或单抗孵育，通过生物素标记抗体和链霉素标记藻红蛋白双重识别，经国产多重荧光生物分析系统检测得到荧光中位数值（median fluorescent intensity,MFI）。比较国产微球及Luminex微球与国产流式荧光平台的适配性、检测区间及性能、热稳定性等指标，采用交叉法及实验设计（Design of Experiment,DoE）优化检测条件，并对该方法进行验证。结果 筛选的国产荧光微球和Luminex微球均能被国产多重荧光生物分析系统正确识别，且每种微球均能特异性聚集。9种HPV型别特异性单抗校准曲线拟合度R~2均> 0.99，在微球的热加速稳定性试验中，国产微球相较于Luminex微球更稳定，且检测偏差更小。该方法检测特异性良好，单重微球分别检测及多重微球同时检测9型标准品及临床血清样本的浓度偏差均在±20%以内。方法的定量区间倍差均超过4 000倍，HPV6/16/18/31/58型为0.015 3～62.5 ng/mL,HPV11为0.061 0～250 ng/mL,HPV33/52为0.030 5～125 ng/mL,HPV45为0.007 6～31.25 ng/mL，且标准曲线和临床血清样本的平行性良好，可满足临床血清样本定量检测的要求；检测方法的准确度回收率偏差<15%，精密度偏差<10%，方法总误差<25%，样本的稀释线性、选择性（高脂血清样本干扰性）、血清样本冻融稳定性均符合《中国药典》四部（2020版）要求。结论 基于国产流式荧光生物分析系统及荧光微球，成功建立了HPV临床血清IgG抗体定量检测方法，打破了Luminex平台的技术壁垒，检测成本更低，可及性更好，可用于多价型疫苗的免疫原性评价。
2024年12期 v.37 1453-1462页 [查看摘要][在线阅读][下载 1289K] [下载次数：189 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 郑宵蓓;王月;邓琨;龚钦;成立;周志军;郭佳茹;杨轶;童剑啸;柯兵兵;张金;
目的 对静注人免疫球蛋白（pH 4）[human immunoglobulin(pH 4)for intravenous injection,IVIG，简称静丙]成品中人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）检测（ELISA法）的pH条件进行摸索，以期控制静丙HIV的残余风险，保证血液制品的安全性。方法 使用不同pH缓冲液稀释HIV抗体标准物质及抗原标准物质至检测限水平，观察试剂盒对不同pH、检测限水平HIV标准物质的检出情况，进而得出试剂盒适宜pH检出范围。使用不同浓度的Tris-HCl溶液调节静丙成品至试剂盒适宜pH范围，然后稀释HIV抗体标准物质及抗原标准物质至检测限水平，获得静丙适宜的pH检出范围。结果 HIV抗体标准物质和HIV抗原标准物质检测缓冲液pH 7.0～9.0组的A450/630值与生理盐水（NS）组相近，所用HIV试剂盒适宜pH范围为7.0～9.0。0.1 mol/L Tris-HCl溶液稀释静丙4.0至试剂盒适宜pH范围作为稀释液，抗体0.25 NCU/mL水平在静丙pH 7.0～8.0组检测A450/630值高于cutoff值，且明显高于静丙pH 4.0组，0.1 mol/L Tris-HCl溶液加入量占静丙体积1/5以上。1 mol/L Tris-HCl溶液稀释静丙4.0至试剂盒适宜pH范围作为稀释液，抗体0.25 NCU/mL和抗原1.5 U/mL水平在静丙pH 7.0～9.0组检测A450/630值高于cutoff值，1 mol/L Tris-HCl溶液加入量仅为检测总体积的1/28～1/37，对待检样品的有效检测含量几乎不产生影响。结论 相较于pH 4.0的检测条件，pH 7.5～8.0更适用于静丙的HIV检测。确定采用1 mol/L Tris-HCl溶液调节静丙pH至7.5～8.0用于静丙HIV检测（ELISA法）。有效解决了静丙成品pH偏酸不利于HIV检出的问题，同时未对静丙成品的检测体积产生影响，显著提升了检测结果的准确性和可靠性。
2024年12期 v.37 1463-1469页 [查看摘要][在线阅读][下载 842K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ] - 吴小红;王新竹;苏歧;赵丹华;徐宏山;刘欣玉;姜崴;叶强;
目的 建立稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体内效力假病毒中和试验（pseudovirus-based neutralization assay,PBNA）检测方法，并对方法进行验证，以用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法 设3种不同BALB/c小鼠（雌雄各半）免疫程序，每种免疫程序均免疫2针疫苗，PBNA法检测血清中和抗体（neutralizing antibody,Nab）效价，筛选适合的免疫程序；确定免疫程序后，以0.5～6μg/只范围进行免疫，进一步确定血清Nab效价与免疫剂量的线性范围，建立SARS-CoV-2 mRNA疫苗体内效力检测的PBNA法，并对方法相对准确度、中间精密度、线性与范围进行验证；采用建立的方法检测3批Omicron XBB.1.5变异株SARS-CoV-2 mRNA疫苗体内效力，与企业原检测方法检测结果进行比对。结果 确定疫苗免疫程序为初免后间隔14 d加强免疫1针后7 d采血，每针免疫剂量为2μg/只，线性剂量范围为0.5～3μg/只，建立了SARS-CoV-2 mRNA疫苗小鼠体内效力检测的PBNA方法。该方法检测的每个效价水平相对偏倚（relative bias,RB）均在±20%内，满足相对准确度要求；每个效价水平6次测定值的几何变异系数（geometric coefficient of variation,GCV）均小于50%，满足中间精密度要求；拟合直线回归方程y=1.003 4 x-0.0117,r=0.8870，直线呈显著回归（P=9.67×10~(-15)），符合线性可接受标准；效价水平范围为25%～150%，满足常见疫苗体内效力质量标准范围。3批Omicron XBB.1.5变异株SARS-CoV-2 mRNA疫苗效价检测结果与原方法相符，可用于体内效力检测。结论 建立了稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体内效力假病毒中和试验检测方法，该方法可应用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。
2024年12期 v.37 1470-1475+1483页 [查看摘要][在线阅读][下载 888K] [下载次数：207 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：10 ] - 张逸驰;李媛媛;边雅静;吴清胜;孙立影;郭胜华;白云鹏;张占东;佟雪莲;姚春萍;李静;王昌昊;
目的 优化昆虫-杆状病毒表达系统培养工艺，进一步提高重组戊型肝炎类病毒颗粒（hepatitis E virus-like particles,HEV-LPs）蛋白表达量，并进行工艺放大及验证。方法 对Sf9昆虫细胞进行无血清悬浮培养，通过摇瓶级联放大，建立7 L生物反应器培养工艺，并对细胞接种重组戊型肝炎杆状病毒时的活细胞密度、培养温度及病毒接种比例等参数进行优化，观察细胞生长状态，分析目的蛋白表达量，对目的蛋白采用SDS-PAGE、Western blot、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）、透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）检测，综合分析HEV-LPs颗粒形态及蛋白产量，确定适合的重组HEV-LPs培养表达参数，进行连续3批7 L规模重组戊型肝炎疫苗的制备。结果 7 L生物反应器对昆虫细胞最佳培养参数为：搅拌速度90 r/min,pH(6.2±0.1)，培养温度27℃，接种重组杆状病毒的细胞密度6.0×10~6 cells/mL，溶氧90%。此时，表达的HEV-LPs目的蛋白相对分子质量约58 000，可与HEV鼠源单克隆抗体特异性结合；最终产量为60～70 mg/L，纯度大于95%;TEM镜下可见球形颗粒，直径约20 nm。应用优化参数制备的HEV-LPs重组蛋白产量稳定、颗粒形态均一。结论 成功优化了重组戊型肝炎疫苗培养表达工艺，并进行了放大工艺的稳定性验证，为重组戊型肝炎疫苗生产工艺的研发奠定了基础。
2024年12期 v.37 1476-1483页 [查看摘要][在线阅读][下载 1171K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：5 ] - 李静静;刘晓雅;程英杰;吴常伟;黄恩启;
目的 建立基于刺突糖蛋白（S蛋白）受体结合区（receptor-binding domain,RBD）的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法，并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体，HRP标记的CB6人源单克隆抗体（CB6-HRP）为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA法，确定GH4(500、1 000、2 000 ng/mL)及CB6-HRP(3.906 25～500 ng/mL)的工作浓度，并对方法进行线性范围、准确性、精密性、专属性和耐用性验证。采用建立的方法检测3批重组SARS-CoV-2疫苗（CHO细胞）原液的抗原含量。结果 GH4及CB6-HRP的工作浓度分别为1 000和31.25 ng/mL。原液参比品在0.488～125 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系，R~2均> 0.99；准确性验证的回收率在87.2%～120.5%之间；重复性和中间精密性验证的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均<20.0%；专属性验证的错误率在-16.6%～2.1%之间；耐用性验证的RSD均<20.0%。3批疫苗原液抗原含量分别为638.9、592.4、664.8 ng/mL,RSD为5.8%。结论 建立的基于S蛋白RBD的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性，可用于重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的检测，为该疫苗的质量控制奠定了基础。
2024年12期 v.37 1484-1489+1494页 [查看摘要][在线阅读][下载 868K] [下载次数：251 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 权娅茹;任晋楷;陈震;邱平;万文妍;李长贵;陈国庆;
目的 比较建立的酶联免疫吸附（ELISA）法与膜免疫荧光抗体（fluorescent antibody-to-membrane antigen,FAMA）法对水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）IgG抗体水平的检测能力，为疫苗免疫效果评价及辅助免疫策略的研究提供参考。方法 使用糖蛋白E(gE)/糖蛋白B(gB)作为包被抗原，建立定量检测VZV IgG抗体水平的ELISA法。用建立的ELISA法和FAMA法分别检测2 332份水痘疫苗免疫前后各1 166份血清样品的VZV IgG抗体水平，并将两种方法检测结果进行比对。结果 ELISA法与FAMA法检测的总阳性率分别为88%和89.8%，疫苗免疫前血清样品阳性率为76.3%和79.6%，免疫后血清样品阳性率为99.7%和100%；两种方法总符合率为95.8%,Kappa值为0.789;ELISA法与FAMA法检测的抗体水平结果相关系数（R~2）=0.705。结论 建立的ELISA法与FAMA法具有较高的一致性和相关性，可用于疫苗免疫效果评价及免疫策略的研究等。
2024年12期 v.37 1490-1494页 [查看摘要][在线阅读][下载 813K] [下载次数：228 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 杨颢;时景景;周宇荀;李凯;肖君华;
目的 建立基于多重荧光定量PCR的CHO宿主细胞DNA残留量及片段化程度的检测方法，并进行验证，以期为相关疫苗安全性检测提供可靠的方法。方法 根据CHO细胞Alu序列家族成员clone250和clone49c设计长短2套引物（Alu-L及Alu）及共用探针，同时引入辣椒叶UBI3基因作为外标基因，设计相应引物及探针，建立Alu序列与外标基因的多重反应体系，通过多重荧光定量PCR法对样本中CHO细胞DNA残留量进行定量检测，并验证方法的线性范围、定量限、专属性、耐用性、精密性、准确性。另通过比较Alu长短序列扩增曲线的△Ct[Ct(Alu-L)-Ct(Alu)]，判断CHO细胞DNA片段化程度。结果 多重反应标准曲线在0.001～0.1 ng/μL浓度范围内，与Ct值呈良好的线性关系，R~2≥0.99，外标基因的加入不影响对CHO靶标的检测能力；方法的定量限为0.5 fg/μL；人类、E.coli、大鼠、小鼠DNA对检测无影响，针对CHO细胞残留DNA的引物探针在7种动物细胞系基因组中无特异性扩增；碎片化DNA样本不影响检测结果；精密性验证变异系数（CV）均<15%；在含1%BSA的生理盐水和PBS 2种溶剂中模拟样本回收率均在70%～130%范围内。Alu长短片段扩增曲线△Ct随样本碎片化程度的升高而增加，拟合曲线R~2≥0.99。结论本研究建立的多重荧光定量PCR检测方法能够快速准确地对CHO细胞残留DNA进行定量，还可根据△Ct判断样本片段化程度，可用于相关疫苗安全性的检测。
2024年12期 v.37 1495-1504页 [查看摘要][在线阅读][下载 1249K] [下载次数：231 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：6 ] - 刘艳;何鹏;李娟娟;申瑷琳;肖瑶;彭小欢;郭旭梦;姚瑞宁;胡忠玉;施金荣;
目的 利用磁珠分离法结合荧光染色法，建立口服六价重配轮状病毒（rotavirus,RV）减毒活疫苗（Vero细胞）原液及成品中DNA残留量的检测方法，并进行验证。方法 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（磁珠法）提取样品中的残留Vero细胞DNA，再利用荧光染色对样品中残留DNA进行测定，采用直线回归拟合标准曲线并对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行线性范围、精密度、准确度、专属性、耐用性、定量限验证。对6个血清型的单价原液和成品中的残留宿主细胞DNA进行测定，并采用3种不同方法（荧光染色法、qPCR法、分子杂交法）进行检测，比较检测结果的一致性。结果 该方法检测口服六价重配RV减毒活疫苗（Vero细胞）DNA残留量的定量限为1.25 ng/mL，标准品浓度在1.25～80 ng/mL范围内线性关系良好，线性相关系数（r）为1.00；单价原液重复检测6次的加标回收率在93.8%～132.1%之间，成品重复检测6次的加标回收率在66.0%～90.0%之间；同一人员对单价原液和成品重复检测6次的相对标准差（relative standard deviation,RSD）在5.5%～16.1%之间，不同人员对单价原液和成品重复检测6次的RSD分别为7.7%和15.6%；用干扰溶液与RNase-free Water分别稀释标准品至25μg/mL,Vero细胞DNA残留量检测结果的回收率在98.0%～138.8%之间，RSD <12%；单价原液和成品不同孵育时间检测结果的RSD分别<16.3%和8.6%；不同时间和不同实验室对6个不同血清型的单价原液和3批成品中DNA残留量检测结果的RSD <7.1%和6.1%;3种不同方法对同一份样品的检测结果一致性较好。结论 磁珠分离法和荧光染色法相结合可用于口服六价重配RV减毒活疫苗（Vero细胞）DNA残留的含量测定，同时也可作为工艺过程中对中间品等关键步骤的评价手段。
2024年12期 v.37 1505-1511页 [查看摘要][在线阅读][下载 842K] [下载次数：153 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 王玺;阮朝列;杨璐洁;李卫东;周健;
目的 对MDCK细胞悬浮培养流感病毒H3N2过程中4个关键控制参数：酸碱度（pH）、病毒加量（MOI）、TPCK胰蛋白酶加量、细胞密度进行平衡和优化，以期提升MDCK细胞悬浮培养H3N2病毒的生产效率和病毒滴度。方法利用Sartorius（赛多利斯）公司实验设计（Design of Experiment,DoE）软件MODDE~?设计多因素交互实验方案，确定和优化在pH、MOI、TPCK胰蛋白酶加量、细胞密度4个条件会交互影响的前提下H3N2病毒的感染性滴度（TCID_(50)），使感染性滴度能在4个因素的一定范围内达到较好效果。结果 MDCK细胞悬浮培养H3N2病毒的最佳培养条件取值范围为：pH=7.88～8.00,MOI=0.001,TPCK终浓度1.70～6.0μg/mL，细胞密度（55.70～77.28）×10~5个/mL，病毒维持培养基为Xene-S001培养基，培养温度为34.5℃，培养时间为72 h，摇床转速为100 r/min,CO_2含量为3%，在此条件下，H3N2病毒TCID_(50)为6.5；重复试验显示，TCID_(50)CV为1.03%，重复性和稳定性好。结论 H3N2病毒在MDCK细胞上悬浮培养可获得较高的病毒滴度。
2024年12期 v.37 1512-1517页 [查看摘要][在线阅读][下载 915K] [下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ] - 蔡梦瑶;朱德武;陈雯;刘宏博;唐荣兴;付烈;李喆;
目的 建立基于中和抗体的白喉类毒素（diphtheria toxoid,DTd）功能性抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法，并进行验证及初步应用，以用于DTd生产过程中的质量分析。方法 采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法中抗白喉毒素（diphtheria toxin,DTx）包被抗体和检测抗体的浓度，建立线性标准曲线，参照《中国药典》四部（2020版）要求对方法进行验证，并初步应用于DTd原液检测。结果 双抗体夹心ELISA检测方法的最佳包被抗体浓度为5μg/mL，检测抗体稀释比例为1∶5 000，线性检测范围为0.000 781～0.012 5 Lf/mL(r> 0.99)。该方法与百日咳类毒素（pertussis toxoid,PTd）、百日咳丝状血凝素（filamentous haemagglutinin,FHA）、百日咳黏附素（pertactin,PRN）、破伤风类毒素（tetanus toxoid,TTd）及Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin-strain inactivated poliomyelitis vaccine,sIPV）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均无交叉反应；检测线性范围内DTd标准品，精密度验证的变异系数（CV）分别为4.23%、2.98%、1.81%、6.61%、1.82%，准确度验证的回收率分别为90.67%、105.39%、102.11%、97.76%、81.31%。采用该方法与絮状试验法共同测定12批DTd原液中类毒素含量的Pearson r为0.638 0(P <0.05)；检测浓度低于1 800 Lf/mL的原液，Pearson r为0.899 2(P <0.001)。结论 成功建立了基于中和抗体的DTd抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法，该方法专属性、准确度、精密度良好，为DTd原液生产提供了一种有效的检定手段。
2024年12期 v.37 1518-1523页 [查看摘要][在线阅读][下载 845K] [下载次数：308 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ]