- 单彪;卞良;李书君;王佩显;吴殿超;雷秋香;刘登湘;
目的 探讨微小RNA-19a(miR-19a)在胃癌组织和血清中的表达及其对人胃癌AGS细胞增殖、侵袭能力的影响和血小板反应蛋白1(thrombospondin 1,THBS1)表达的调控作用。方法 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测22份胃癌组织、相应癌旁组织、血清及22份健康人群血清中miR-19a的表达量。将体外培养的人胃癌AGS细胞分为对照、inhibitor NC、mimics NC、miR-19a inhibitor、miR-19a mimics、miR-19a inhibitor+si-NC和miR-19a inhibitor+siTHBS1组,每组设3个复孔。对照组不做任何处理,其余组采用Lipofectamine~(TM)2000脂质体分别转染inhibitor NC、mimics NC、miR-19a inhibitor、miR-19a mimics、miR-19a inhibitor+si-NC和miR-19a inhibitor+si-THBS1,转染24 h后,分别采用RT-qPCR、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)、Transwell小室、Western blot法分别检测各组细胞miR-19a的表达、细胞活力、增殖率、侵袭数及相关蛋白表达水平。结果 胃癌组织中miR-19a的表达水平明显高于相应癌旁组织(t=5.061,P <0.001),胃癌患者血清中miR-19a的表达水平明显高于健康人群血清(t=6.299,P <0.001)。miR-19a inhibitor组AGS细胞中miR-19a的表达水平显著低于inhibitor NC组(t=11.120,P <0.001),miR-19a mimics组miR-19a的表达水平显著高于mimics NC组(t=11.637,P <0.001),miR-19a inhibitor+si-THBS1组THBS1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于miR-19a inhibitor+si-NC组(t分别为10.070和13.164,P分别为0.001和<0.001)。与inhibitor NC组相比,miR-19a inhibitor组AGS细胞活力、增殖率、侵袭数及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平均显著降低(t分别为16.679、10.072、17.737、11.173、11.549,P均<0.001),THBS1蛋白表达水平显著升高(t=16.774,P <0.001);与mimics NC组相比,miR-19a mimics组AGS细胞活力、增殖率、侵袭数及Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平均显著升高(t分别为15.004、22.746、13.349、11.484、19.022,P均<0.001),THBS1蛋白表达水平显著降低(t=16.384,P <0.001);与miR-19a inhibitor+si-NC组相比,miR-19a inhibitor+si-THBS1组AGS细胞活力、增殖率、侵袭数及Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平均显著升高(t分别为13.180、8.669、14.493、6.828、13.587,P均<0.001),THBS1蛋白表达水平显著降低(t=14.824,P <0.001)。结论 miR-19a在胃癌组织及胃癌患者血清中呈高表达状态,敲低miR-19a可能通过激活THBS1表达抑制人胃癌AGS细胞的增殖和侵袭能力。
2025年01期 v.38 34-41+47页 [查看摘要][在线阅读][下载 1105K] [下载次数:9 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ] - 程诚;钱汶;王龙龙;温佳楠;张涛;汪小东;丁利平;毛子安;
目的 评价冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_2株)上市后的安全性和免疫原性,以期作为免疫规划疫苗推广使用。方法 对5 000例18~24月龄健康婴幼儿接种1剂冻干甲型肝炎减毒活疫苗,观察接种后0~14 d的不良事件,其中200例入选免疫原性亚组,检测免疫前后8周血清中甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)特异性IgG抗体水平。结果 5 000例完成入组接种,4 999例完成安全性观察。报告征集性不良反应424例,不良反应发生率8.48%,征集性局部不良反应以接种部位红晕、触痛、瘙痒、皮疹、肿胀为主,征集性全身不良反应以发热、厌食为主,严重程度以1~2级为主,未发生与疫苗有关的严重不良事件。200例免疫原性亚组中有188例受试者纳入符合方案集(per protocol set,PPS),抗体阳转率为98.91%[95%可信区间(confidence interval,CI):96.11%~99.87%],HAV特异性IgG抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)为83.67 mIU/mL(95%CI:77.05~90.85 mIU/mL)。结论 单剂冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_2株)对18~24月龄婴幼儿具有良好的安全性和免疫原性。
2025年01期 v.38 42-47页 [查看摘要][在线阅读][下载 778K] [下载次数:6 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 刘煜菡;张名;陈俊薇;郭伟;冯昌增;马绍辉;
目的 对从2019年云南省昆明市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患者的粪便样品分离获得的1株埃可病毒11型(echovirus 11,E-11)毒株进行全基因组测序及遗传特性分析,为E-11的预防和控制提供参考。方法 利用Vero细胞进行病毒分离,提取细胞病变产物的RNA进行RT-PCR并测序,使用MEGA 7.0、Geneious 10.0和Simplot 3.5.1等软件对分离的毒株进行全基因组序列分析。结果 19V30322/YN/CHN/2019分离株经测序比对为E-11,与近年来中国广东和湖北的E-11流行株属于同一基因型D的D5亚型,全长为7 434 nt,编码1个2 195氨基酸的多聚蛋白。19V30322与国内分离的E-11分离株核苷酸序列相似性为81.8%~98.3%,氨基酸序列相似性为94.5%~99.3%,并在进化过程中与柯萨奇病毒A组10型、E-6、柯萨奇病毒B组4型和柯萨奇病毒B组5型发生重组。结论 19V3/YN/CHN/2019分离株为E-11的D5亚型,是1株重组株。
2025年01期 v.38 48-52页 [查看摘要][在线阅读][下载 1079K] [下载次数:1 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ]
- 杨欢;非成瑞;王思捷;申雪;杨力;吴凡;
目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)中游离甲醛含量柱前衍生-高效液相色谱检测方法,并进行验证及应用,以期为测定疫苗中游离甲醛含量提供新的方法。方法 样品用2,4-二硝基苯肼衍生后,经C18色谱柱(5μm,120?,4.6 mm×250 mm)分离,分别对检测波长、流动相比例、流速、衍生时间、温度、缓冲液和衍生容器等检测条件进行优化,并对方法进行专属性、线性、重复性、准确性、检测限和定量限、耐用性验证。采用优化的方法检测20批脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)中游离甲醛含量。结果 色谱条件:以乙腈∶水体积分数70∶30为流动相,流速0.6 mL/min,波长352 nm进行测定;衍生条件:加入2,4-二硝基苯肼乙腈溶液0.5 mL和pH 5.0的缓冲液0.25 mL,60℃水浴20 min。该色谱分离条件能够有效分离2,4-二硝基苯肼及甲醛衍生物,且乙醛对测定结果无影响;甲醛标准品浓度在0.05~100μg/mL范围内与峰面积线性关系良好,r为0.999 9;重复性试验中6次检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.36%;9份加标供试品溶液甲醛含量回收率在102.0%~107.0%之间;检出限和定量限分别为0.025和0.05μg/mL;样品衍生后48 h能够稳定存在,耐用性较好。同一批次样品结果重复性较好,甲醛含量在4.5~9.9μg/剂之间。结论 建立的方法具有测定范围宽、线性好、准确性高等优点,能够对Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)中游离甲醛进行准确定量,可作为疫苗产品游离甲醛含量的辅助检测方法,对疫苗批签发和质量监管具有重要意义。
2025年01期 v.38 53-60页 [查看摘要][在线阅读][下载 859K] [下载次数:7 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 刘莹;李静静;赵永杰;冯静静;毛慧芳;刘晓雅;
目的 建立重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗体外相对效力的检测方法,并进行验证,以期为替代体内效力检测奠定基础。方法 以人源单克隆抗体GH4作为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体作为酶标抗体的双抗体夹心ELISA法为基础,确定疫苗解吸附方法;再以该解吸附方法结合双抗体夹心ELISA法建立体外相对效力检测方法。并验证方法的线性范围、专属性、准确性、精密性、耐用性及定量限。采用建立的方法检测3批供试品重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗的体外相对效力。结果 确定解吸附方法为:将疫苗与处理液(1.25 mL 20%二乙醇胺,0.20 mL 10%Triton X-100,8.55 mL PBS)按等体积分数混合,于25℃解离30 min,解吸附率可达95%以上。疫苗参考品在1~26 ng/mL浓度范围内,与A_(450)呈良好的线性关系,线性方程为log(y)=1.447 log(x)-1.643,R~2为0.998;可特异性检测疫苗参考品的体外相对效力;90 000、50 000和20 000 ng/mL浓度疫苗参比品检测结果的回收率均在80%~120%范围内;重复性及中间精密性验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20%;解离条件、检测体系孵育时间和显色时间发生微小变动时,检测结果不受影响;定量限为0.2。批号为J202301002、J202301003、J202301004供试品的体外相对效力分别为1.0,1.0和0.8,RSD为11%。结论 建立的用于检测体外相对效力的方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性,可用于重组Omicron BA.4/5-Delta株新冠疫苗体外相对效力的检测。
2025年01期 v.38 61-66页 [查看摘要][在线阅读][下载 833K] [下载次数:2 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 席小燕;林玉兰;卢金莹;陈惠权;彭凌;
目的 建立快速检测艰难梭菌毒素A(Clostridium difficile toxin A,TcdA)和B(TcdB)的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)感染的快速检测和毒素分型提供技术支持。方法 根据TcdA和TcdB基因的保守序列各设计1套LAMP引物,在同一体系内进行双重LAMP扩增,通过对反应体系和反应条件的优化,建立快速检测TcdA和TcdB的LAMP方法,对该方法进行特异性和灵敏度验证,并对LAMP扩增产物进行熔解曲线分析。用建立的方法对18份腹泻患者粪便样本进行检测。结果 TcdA和TcdB均能进行较好扩增的双重LAMP反应条件为:Mg~(2+)浓度6.8 mmol/L,dNTPs浓度1.2 mmol/L,扩增温度64℃。扩增结果可采用SYBR GreenⅠ染色完成初步检测,目标基因(菌)显示翠绿色荧光,6种其他常见肠道病原体(大肠埃希菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌、肉毒梭菌)无荧光;双重LAMP体系检测TcdA和TcdB的灵敏度分别为10~0和10~1个质粒/反应,通过分析熔解曲线的特征峰可判断CD菌株所含的确切目标毒素。18份腹泻患者粪便样本中有8份样本初步检测为阳性,经溶解曲线分析,均含TcdA和TcdB两种毒素。结论 初步建立了TcdA和TcdB双重LAMP检测方法,该方法具有较好的灵敏度和特异性,可用于CD感染的快速检测,并可实现TcdA与TcdB的同时快速检测。
2025年01期 v.38 67-72+79页 [查看摘要][在线阅读][下载 1012K] [下载次数:5 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ] - 范文红;安怡芳;裴德宁;韩春梅;郭莹;周勇;
目的 建立简便快捷的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(recombinant human tumor necrosis factor receptorⅡ,rhTNFRⅡ)抗体融合蛋白(rhTNFRⅡ-Fc)制品生物学活性测定方法,并对方法进行验证及应用,为该类制品工艺稳定性评价奠定基础。方法 利用HEK293T-NF-κB-Luc转基因细胞,不同浓度rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白能够不同程度抑制TNF-α对转基因细胞中核因子(nuclear factor,NF)-kB的转录激活作用,通过荧光素酶检测系统(Bright-Glo~(TM)-Luciferase Assay System)对rhTNFRⅡ-Fc进行生物学活性检测,并对该方法进行试验参数的优化及专属性、准确性、线性及精密性验证。以rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白生物学活性测定国际标准品作为参比品,采用该方法测定原研药依那西普及国内3家不同企业(A、B、C)各1批rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白产品的比活性。结果 rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白在该方法中存在量效关系,且符合四参数曲线方程,R~2> 0.99;方法优化后确定细胞铺板浓度为4×10~5个/mL,TNF-α作用浓度为10 ng/mL,rhTNFRⅡ-Fc稀释起始浓度为200 ng/mL,1∶1.5倍稀释,作用时间为4~5 h,样品稀释液为DMEM+1%FBS。仅依那西普产品能够抑制TNF-α对HEK293T-NF-κB-Luc细胞中NF-κB的转录激活,而其他几种融合蛋白类制品均无对TNF-α的诱导抑制作用;5个不同稀释组回收率样本经3次测定,回收率平均值分别为(101.54±4.63)%、(99.67±6.41)%、(101.20±5.58)%、(101.44±6.80)%、(100.72±6.15)%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于7%,线性拟合的R~2=0.999 8;精密性验证日间和板间RSD均小于8.0%。该方法检测原研药依那西普及A、B、C企业rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白的比活性分别为2.01×10~6、2.59×10~6、1.56×10~6、2.04×10~6IU/mg。结论 利用HEK293T-NF-κB-Luc转基因细胞成功建立了rhTNFRⅡ-Fc融合蛋白生物学活性测定方法,该方法简便快捷,专属性强,准确性高,精密性良好,可用于不同企业该类制品的生物学活性常规检测。
2025年01期 v.38 73-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 932K] [下载次数:12 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 沙芳芳;隋秀文;周朝东;朱婉玉;徐丽爽;韩强;朱涛;
目的 建立基于肺炎球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)的重组肺炎球菌蛋白疫苗中P3296、P5668和PRX1 3种抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行优化、验证和初步应用,以期为该疫苗的质量监测提供可靠的检测方法。方法 用P5668、P3296和PRX1纯化蛋白免疫雄性新西兰大白兔,免疫血清经Protein A-Sephaorse 4B亲和层析纯化后,获得P5668、P3296和PRX1多克隆抗体,以其为包被抗体,HRP标记的相应单克隆抗体为酶标抗体建立抗原双抗体夹心ELISA检测方法。优化包被抗体浓度(3种多克隆抗体均稀释为2、4、8μg/mL)及酶标抗体稀释度(HRP标记的P5668单克隆抗体按1∶4 000和1∶8 000稀释、HRP标记的P3296单克隆抗体按1∶40 000和1∶60 000稀释、HRP标记的PRX1单克隆抗体按1∶12 000和1∶24 000稀释)、封闭液种类(1%BSA、1%鱼皮明胶、1%脱脂乳粉和1%酪蛋白)、稀释液种类(纯化水、1×PBS、2×PBS)、稀释液pH(6.4、7.4、8.4),并验证方法的线性范围、特异性、准确性、精密性、耐用性。分别采用建立的方法及Lowry法检测P5668、P3296、PRX1纯化蛋白(各20批),并分析2种方法检测结果的相关性。将3批P5668、P3296和PRX1混合疫苗经丙磺酸内盐解吸附后,采用建立的方法检测P3296、P5668和PRX1抗原含量。结果 纯化的P5668、P3296和PRX1多克隆抗体蛋白浓度分别为1.27、2.20和1.53 mg/mL。P3296、P5668、PRX1多克隆抗体最佳包被浓度均为4μg/mL,HRP标记的P5668、P3296、PRX1单克隆抗体最佳稀释度分别为1∶4 000、1∶60 000、1∶12 000;最佳封闭液为1%BSA,稀释液为1×PBS,稀释液pH为7.4。P5668、P3296和PRX1 3种参考品在3.125~100 ng/mL范围内,与A_(450)呈良好的线性关系,且R~2均>0.99;3种抗原高、中、低浓度加标样本回收率均在80%~120%范围内;3种抗原检测方法均可检出相应的特异性抗原,对其他2种抗原检测结果远低于实际含量或未检出;重复性及中间精密性验证CV均<20%;同一样本在不同条件下检测结果的CV均<20%。ELISA法与Lowry法测定P5668、P3296和PRX1抗原含量的R分别为0.984 6、0.997 0和0.990 9(P均<0.000 1),两种方法呈显著正相关。用建立的方法检测3批P3296、P5668和PRX1混合疫苗抗原含量结果与理论值的符合率为87%~114%。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的特异性、精密性、准确性及耐用性,可用于重组肺炎球菌蛋白疫苗中P3296、P5668和PRX1 3种抗原含量的检测。
2025年01期 v.38 80-88页 [查看摘要][在线阅读][下载 896K] [下载次数:39 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 赵永美;孟明耀;李金美;宋泽鑫;周艳;杨武;李鸿钧;
目的 比较4种人脐带间充质干细胞来源外泌体(exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs-Exos)的提取方法,以期获得简便、高效、经济的外泌体提取方法。方法 传代培养人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs),镜下观察细胞形态,并检测细胞增殖能力、特异性表面抗原表达水平及多向分化潜能。分别采用超速离心法、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法、蔗糖沉淀法和Total Exosome Isolation试剂盒法(简称试剂盒法)4种方法提取HUC-MSCs培养上清液中的hucMSCs-Exos,透射电子显微镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体浓度及颗粒大小,BCA法检测外泌体总蛋白浓度,Western blot法检测外泌体特异性标志蛋白水平。结果 传代培养的HUC-MSCs于镜下观察呈长梭形,漩涡贴壁生长,且细胞增殖速度较快;高表达MSCs特异性表面抗原CD73和CD90,极低表达造血干细胞表面标记物CD34和CD45;具有向脂肪及成骨分化的潜能。4种方法均可提取获得HUCMSCs-Exos,除试剂盒法外,其他3种方法提取的外泌体均呈茶托样双层膜结构且边界清晰;试剂盒法提取外泌体的总蛋白浓度及颗粒浓度均明显高于其他3种方法(F=35.18,P均<0.01);4种方法提取的外泌体均能表达特异性标志物CD63和CD81,除蔗糖沉淀法提取外泌体不表达CD9外,其他方法提取的外泌体均表达CD9。结论 4种方法均能提取获得外泌体,其中超速离心法提取外泌体质量稳定;试剂盒法提取外泌体的产量较高,且更省时、更便捷;PEG沉淀法及蔗糖沉淀法提取外泌体的纯度更高。可根据不同的生产需求,选择合适的外泌体分离技术。
2025年01期 v.38 89-95页 [查看摘要][在线阅读][下载 999K] [下载次数:25 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:1 ] - 张波;王艺诺;孙进;
目的 建立重组人胸腺素β4(recombinant human thymosin beta 4,rh-Tβ4)滴眼液中蛋白含量检测的反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证,以期对rh-Tβ4滴眼液中蛋白含量进行质量控制。方法 用ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以超纯水、乙腈、三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱,紫外检测波长为210 nm,进样量为100μL,流速为1.0 mL/min,柱温为25℃,样品室温度为5℃,以标准曲线法计算滴眼液中蛋白含量;对方法进行系统适用性、专属性、线性与范围、准确性、重复性、中间精密度、溶液稳定性、耐用性验证。用建立的RP-HPLC法检测4批rh-Tβ4滴眼液蛋白含量。结果 系统适用性主峰理论塔板数分别为192 039、185 819、186 348,均不低于5 000,主峰与相邻峰分离度分别为3.88、3.79、3.76,均大于1.5,系统适用性合格;空白溶剂、空白对照均未影响重组rh-Tβ4主峰积分,对检测结果无干扰,方法专属性良好;蛋白含量在50~150μg/mL范围内标准曲线线性良好,相关系数(R~2)为0.992 3,大于0.99;高、中、低浓度标准品回收率分别为98.01%、99.17%、97.70%;同浓度6份样品蛋白含量的RSD为1.38%;不同实验人员不同日期检测同一样品蛋白含量的RSD为1.05%;在0、6、12、18、24 h内,同一份供试品蛋白含量的RSD为0.36%;供试品在23、25和27℃柱温下蛋白含量的RSD为0.45%。4批rh-Tβ4滴眼液蛋白含量分别为0.51、0.51、0.49、0.50 mg/mL,均与标示量一致。结论 建立了rh-Tβ4滴眼液蛋白含量检测的RP-HPLC法,经验证准确可靠,可对rh-Tβ4滴眼液中蛋白含量进行质量控制。
2025年01期 v.38 96-101页 [查看摘要][在线阅读][下载 789K] [下载次数:1 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ] - 龚向莲;黄玉麟;林伟春;杨连威;胡祐;邵珊;张东旭;
目的 研究核酸提取产物中乙醇对实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的影响,为更高灵敏度核酸检测提供乙醇浓度界限。方法 建立重铬酸钾氧化法检测两种商品化磁珠法核酸提取试剂盒提取产物的乙醇残留,检测其是否对qPCR产生影响,再将不同浓度乙醇溶液混合核酸模拟提取产物溶解冷冻干燥处理的qPCR试剂(以下简称冻干试剂)并进行扩增,观察其灵敏度变化,并对Ct值、荧光增益强度和扩增效率进行统计学分析。结果 两种试剂盒的提取产物中残留3%~9%乙醇,对扩增均造成影响,有可能会导致灵敏度下降。对于人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV),乙醇浓度达到4.38%时,荧光增益强度差异有统计学意义(P <0.001),扩增效率出现明显差异;对于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV),乙醇浓度达到2.63%时,荧光增益强度差异有统计学意义(P=0.004);乙醇浓度达到3.50%时,Ct值差异有统计学意义(P=0.004),扩增效率出现明显差异。结论 乙醇会影响qPCR灵敏度、Ct值、荧光增益和扩增效率。为进行更高灵敏度的核酸检测,建议乙醇在提取产物中的残留不超过3.50%。
2025年01期 v.38 102-108+114页 [查看摘要][在线阅读][下载 968K] [下载次数:15 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:5 ]