疫苗研究

• 麻疹病毒N蛋白的原核表达、纯化及其兔抗血清的制备

  杨志辉;安欢欢;吴杰;孟胜利;郭靖;申硕;

  目的 原核表达并纯化麻疹病毒（measles virus,MV）核蛋白（N），免疫家兔后制备兔抗MV N抗血清，并鉴定其特异性。方法 以MV-S191疫苗株基因组为模板，PCR扩增N基因3个片段，构建重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEXMV-N2和pGEX-MV-N3，分别转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达N-末端带有GST标签的融合蛋白GST-MV-N1、GST-MV-N2和GST-MV-N3，纯化后，分别与等体积弗氏完全佐剂（初次免疫）、弗氏不完全佐剂（加强免疫）混合，乳化均匀后各免疫1只雌性家兔，共免疫6次，采集全血，分离血清获得兔抗MV N抗血清，Western blot法及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）鉴定其特异性。结果 重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2和pGEX-MV-N3经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确；表达的GST-MV-N1和GST-MV-N3融合蛋白相对分子质量分别约42 000和39 000，主要以包涵体形式存在，纯度分别为96%和85%，而上清和沉淀中均未见GST-MV-N2融合蛋白的表达；兔抗MV N3抗血清能特异性识别MV-S191感染细胞后表达的N蛋白，且特异性高于兔抗MV-N1抗血清。结论 成功制备了兔抗MV N抗血清，为重组MV疫苗的研发以及MV结构蛋白抗体的制备提供了技术支持。

  2024年09期 v.37 1025-1029+1036页 [查看摘要][在线阅读][下载 950K]
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• 细胞穿透肽递送的流感病毒M2胞外区通用DNA疫苗在小鼠体内的免疫效力

  刘洪港;赵美霞;任维岗;李军伟;

  目的 设计通用甲型流感病毒DNA疫苗，并检测其在小鼠体内的免疫效力。方法 合成含H1N1、H3N2、H9N2亚型甲型流感病毒M2(3M2e)胞外结构域的DNA序列，克隆至载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAX1-3M2e。将质粒pVAX1-3M2e分别与细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine多肽复合物（质量分数1∶1）按不同质量分数混合（1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8），进行凝胶阻滞试验，以确定DNA与CPPs的正确结合；并通过细胞荧光试验在细胞水平（293T细胞）检测CPPs的递送效率。选择RVG9dR+Protamine递送质粒pVAX1-3M2e经肌内免疫雄性BALB/c小鼠（多肽复合物两种剂量：25μg pVAX1-3M2e+500μg多肽复合物、50μg pVAX1-3M2e+1 000μg多肽复合物，每组8只小鼠），检测通用甲型流感病毒DNA疫苗对3种亚型流感病毒（H1N1、H3N2、H9N2）的交叉保护作用。结果 DNA与RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine的最佳结合比分别为1∶2、1∶2、1∶1;RVG9dR+Protamine在1∶20的质量分数下对质粒pVAX1-3M2e具有超强的递送效率；50μg pVAX1-3M2e+1 000μg多肽复合物对3种亚型流感病毒攻毒组小鼠的保护率均为100%。结论 由RVG9dR+Protamine多肽复合物递送的质粒pVAX1-3M2e在小鼠中提供了针对3种亚型甲型流感病毒的交叉保护。

  2024年09期 v.37 1030-1036页 [查看摘要][在线阅读][下载 1039K]
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• 重组乳酸乳球菌表达呼吸道合胞病毒Pre F的免疫原性分析

  赵同悦;高婧;袁蕾;雷涵;

  目的 基于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）口服疫苗，并对其免疫原性进行分析。方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经NcoⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F，电转化至感受态L.lactis NZ3900，经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F，以nisin A为诱导剂诱导表达，经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析；将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组，15只/组，每只口服500μL，于第1、2天进行初次免疫，第16、17天进行加强免疫，第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞，ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平，ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平。结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定，证明构建正确；抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中，相对分子质量约50 000；初次免疫后第14和28天，与PBS和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比，L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高，且差异均有统计学意义（t=-30.268～-3.087,P均<0.05）。结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV口服疫苗具有较强的免疫原性，为研发RSV黏膜疫苗提供了参考，也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法。

  2024年09期 v.37 1037-1042+1049页 [查看摘要][在线阅读][下载 922K]
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基础研究

• 人源R-spondin 2蛋白的生物信息学分析、表达、纯化及活性检测

  耿腾洁;许剑锋;

  目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体，表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc，用3C蛋白酶切除Fc结构域后，检测RSPO2-Fu的生物学活性。方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构，筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu。将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后，将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h，通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc，用3C蛋白酶切去Fc结构域，分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白。最后，通过M50Super 8×TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性。结果 生物信息学分析结果显示，RSPO2全长有243个氨基酸，相对分子质量为28 300，等电点为9.42，为亲水性不稳定蛋白，RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高；重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确；获得了纯度达95%的RSPO2-Fu蛋白；生物学活性检测结果显示，RSPO2-Fu的EC_(50)值为1.5×10~(-12)mol/L。结论 对RSPO2蛋白适当截短后，可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白，其对Wnt信号通路有明显激活作用，为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考。

  2024年09期 v.37 1043-1049页 [查看摘要][在线阅读][下载 1111K]
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• 真核细胞延长因子2基因RNA干扰慢病毒质粒的构建及验证

  张婷婷;薛媛;朱超;段明廷;陈伟豪;常欣悦;王艳红;贾红燕;

  目的 构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型，为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据。方法 根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列，将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shRNA-ZSgreen-Puro，构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3，以空载体作为阴性对照组（shNC）。采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T，进行病毒包装和扩增。经酶切及测序验证正确后，将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光强度，实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平，Western blot法检测eEF2蛋白表达水平。结果 eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致。重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达。与shNC组相比，eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低（t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004）;sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低（t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011）。结论 成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型，有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点。

  2024年09期 v.37 1050-1055页 [查看摘要][在线阅读][下载 984K]
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• 过氧化氢对人卵巢颗粒细胞KGN增殖、自噬及凋亡的影响

  冯光恩;朱晓霞;贾瑜琦;柴蔚然;陈崇伟;于保锋;

  目的 探讨氧化应激对人卵巢颗粒细胞生长发育的影响。方法 体外培养人卵巢颗粒细胞KGN，用不同浓度的过氧化氢（H_2O_2）处理KGN细胞，采用CCK8法检测细胞增殖水平，流式细胞术检测细胞内活性氧族（reactive oxygen species,ROS）产生量及细胞凋亡情况，Western blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。结果 随着H_2O_2浓度的升高，颗粒细胞增殖受到明显抑制，且呈剂量依赖性（F分别为4.906、4.825、4.653、4.614和4.587,P均<0.001）。细胞内ROS水平随着H_2O_2浓度的增加而升高，同时细胞凋亡率不断升高；加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）后，ROS水平恢复，细胞凋亡率下降，表明细胞凋亡与ROS的产生有关。H_2O_2处理后，KGN细胞中LC3-Ⅱ、cleaved-caspase3蛋白的表达水平显著升高（t分别为4.809和5.789,P均<0.05）,LC3-Ⅰ、BCL-2、P62蛋白的表达水平显著降低（t分别为4.014、3.982和4.415,P均<0.05），表明H_2O_2能够诱导KGN细胞的自噬和凋亡。结论 H_2O_2能够抑制人卵巢颗粒细胞增殖，诱导其自噬凋亡。氧化应激状态抑制人卵巢颗粒细胞的生长发育，降低卵母细胞质量，卵巢储备功能下降。

  2024年09期 v.37 1056-1061+1069页 [查看摘要][在线阅读][下载 989K]
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• 结合人血小板裂解液培养人脐带间充质干细胞的基础培养基选择

  王灵娟;刘春香;蔡光辉;芦慧颖;周慧敏;张怡;

  目的 结合人血小板裂解液（platelet lysate,PL）选取一种安全性高、成本低、适用于人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）生长，且在培养过程中不影响细胞各项功能的基础培养基，用于大量高代次hUC-MSC的培养。方法 将MSCBM、α-MEM、IMDM 3种基础培养基分别与PL UltraGROG Advanced进行配比，培养P0～P8代hUC-MSCs，对比不同代次的细胞形态、扩增数量、增殖功能、分化功能及免疫表型，确定适用于HUC-MSCs培养的最佳基础培养基。结果 3种培养基培养的P1～P5代细胞，形态均一，呈放射状生长，与标准的细胞形态相比差异无统计学意义（t_(IMDM VS α-MEM)=0.159,t_(MSCBM VS α-MEM)=0.147,t_(IMDM VS MSCBM)=0.161;P均> 0.05），培养至P6～P8代时，MSCBM、α-MEM培养的细胞与P0～P5代细胞形态相比，差异无统计学意义（t_(IMDM VS MSCBM)=0.132,t_(IMDM VS α-MEM)=0.128;P均> 0.05）;MSCBM、α-MEM、IMDM培养的P1～P8代细胞阳性表达CD73、CD90、CD105，表达率均约达99%，阴性表达CD34、CD45，表达率均低于2%，不同培养基间差异无统计学意义（t_(IMDM VS α-MEM)=0.102,t_(MSCBM VS α-MEM)=0.106,t_(IMDM VS MSCBM)=0.113;P均> 0.05）;3种培养基培养的P8代细胞克隆形成性不同，MSCBM培养的细胞形成的单个克隆团和克隆团内细胞数量均高于α-MEM、IMDM培养的同代次细胞（t分别为0.023、0.049,P均<0.05）;3种培养基培养的细胞增殖功能由高到低分别为MSCBM、α-MEM、IMDM，其中MSCBM显著高于IMDM(t=0.041,P <0.05)，而与α-MEM差异无统计学意义（t=0.211,P> 0.05），倍增时间（DT）与增殖功能结果一致；3种培养基培养的同代次细胞均具有较强分化功能，培养的P8代细胞分化成骨和成软骨的细胞数量无显著差异（t_(IMDM VS α-MEM=0.119,t_(MSCBM VS α-MEM)=0.112,t_(IMDM VS MSCBM)=0.111;P均> 0.05）,MSCBM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于α-MEM培养的P8代细胞（t=0.036,P <0.05）,α-MEM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于IMDM培养的P8代细胞（t=0.031,P <0.05）。结论 确定了最佳hUC-MSCs培养体系为MSMBM添加5%UltraGROG Advanced，其次为α-MEM添加5%UltraGROG Advanced，建议选择此两种无血清培养体系用于MSCs的大规模培养。

  2024年09期 v.37 1062-1069页 [查看摘要][在线阅读][下载 1222K]
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• 紫色色杆菌转氨酶基因表达载体的构建及其原核表达

  陈存;刘韩;翁静凤;杨运航;任迎虹;

  目的 利用紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的转氨酶（CV2025）基因序列构建重组质粒pET-28aCV2025，并在大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）中进行原核表达。方法 将CV2025基因序列与pET-28a（+）载体连接，构建重组质粒pET-28a-CV2025，转化E.coli TOP10中进行阳性克隆子筛选，经双酶切及测序验证后，转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta，诱导表达目的蛋白；将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基，IPTG诱导表达制备粗酶液后，以异丙胺为氨基供体，1-（4-甲氧苯基）乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体，采用薄层色谱法监测反应，初步检验转氨酶活性，高效液相色谱法进行进一步分析。结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确；重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带，且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在；酶液催化后，1-（4-甲氧苯基）乙酮与异丙胺发生转氨基化反应，生成对应的手性胺1-（4-甲氧苯基）乙胺，具有一定的催化活性。结论 在E.coli中成功表达了CV2025，初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性，为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础。

  2024年09期 v.37 1070-1074页 [查看摘要][在线阅读][下载 872K]
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• 恩诺沙星对鼠疫耶尔森菌L型的诱导作用

  李朋伟;王婷;张婷婷;孙田华;蒋保余;马维民;王彩霞;吴智远;焦磊;

  目的 探讨恩诺沙星对鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）L型的诱导作用，以期了解更多鼠疫菌L型的形成条件和生物学特性。方法 将鼠疫菌EV株分别接种于含0、0.5、5、10、50、100、500、1 000 ng/mL恩诺沙星的赫氏培养基中培养。将含50 ng/mL恩诺沙星的培养物接种于不含恩诺沙星的赫氏培养基中进行返祖培养。观察各样品菌落形态，通过革兰染色和细胞壁染色观察细菌形态，透射电镜观察细胞壁状态。对鼠疫菌EV株和鼠疫菌L型进行16S rDNA鉴定，并进行同源性分析及构建系统发育树。结果 赫氏培养基中含0.5 ng/mL恩诺沙星可引起鼠疫菌形态改变，由典型短杆菌变为长杆菌。恩诺沙星浓度为50 ng/mL时鼠疫菌细胞壁缺失，细菌无法正常分裂增殖而呈长杆状，盘绕成团，菌落呈油煎蛋样。恩诺沙星诱导鼠疫菌L型在正常赫氏培养基中可返祖，并表现为短小杆状的典型鼠疫菌形态。16S rDNA鉴定诱导菌与诱导前亲本EV株同源性为100%。结论 恩诺沙星可诱导鼠疫菌形成L型。

  2024年09期 v.37 1075-1079页 [查看摘要][在线阅读][下载 934K]
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• RSPO1蛋白的纯化及其免疫淘选

  杜梦阳;许剑锋;

  目的 通过噬菌体展示技术，从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体，纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库，并进行免疫淘选。方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后，构建质粒RSPO1-pCMVFc，瞬时转染HEK-293F细胞，表达RSPO1蛋白；经Protein A凝胶柱、HiLoad~(TM)16/600 Superdex~(TM)200pg柱、Superdex~(TM)24 Increase10/300 GL柱依次纯化RSPO1蛋白后，免疫骆驼，收集外周血并分离淋巴细胞；提取细胞RNA，反转录合成cDNA，通过2步巣式PCR扩增VHH片段，克隆至pMECS噬菌粒载体中，构建噬菌体展示文库，经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后，进行ELISA鉴定并测序。结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确。表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000，纯度约为70%;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2×108cfu，经2轮淘选使噬菌体富集度达到12；共获得19个纳米抗体序列。结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列，为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能。

  2024年09期 v.37 1080-1084页 [查看摘要][在线阅读][下载 926K]
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诊断制剂

• 仙台病毒假病毒装甲RNA标准质控品的制备及其应用

  齐欣尧;李明;费东亮;孙莉;马跃宇;马鸣潇;

  目的 基于Ms2噬菌体制备内含仙台病毒（Sendai virus,SeV）RNA的假病毒装甲RNA标准质控品，以期应用于SeV感染的诊断及该病毒的分子生物学安全检测。方法 将SeV的L基因片段插入质粒pET-28b-Ms2中，构建重组质粒pET-28b-Ms2-L(SeV)。将重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达重组蛋白，即SeV假病毒装甲RNA标准质控品。将标准质控品置电镜下观察其形态，并进行10%SDS-PAGE分析、抗DNaseⅠ及抗RNsaeA试验、稳定性分析。采用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术对SeV、小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus,MHV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice,PVM）、汉坦病毒（Hantaan virus,HV）、呼肠弧病毒Ⅲ型（reovirus typeⅢ，ReoⅢ）、小鼠细小病毒（minute virus of mice,MVM）进行检测，验证标准质控品的效果。结果 标准质控品于电镜下呈Ms2噬菌体假病毒颗粒结构，相对分子质量约为14 000，可有效抵抗DNaseⅠ及RNsaeA的降解。标准质控品于-80℃保存6个月、-20℃保存6个月、28℃保存5、10、15 d后仍具有良好的稳定性。仅SeV可见RPA特异性扩增曲线，其他病毒均未出现扩增曲线。结论 本研究构建的SeV假病毒装甲RNA标准质控品具有良好的稳定性及特异性，可作为SeV的各项分子生物学安全检测的阳性对照。

  2024年09期 v.37 1085-1089+1095页 [查看摘要][在线阅读][下载 883K]
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治疗制剂

• 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂治疗骨关节炎的药效学分析

  刘畅;刘玉林;刘涵;顾笑宇;俞露;郁仁龙;何秀霞;

  目的 观察重组人白细胞介素-1受体拮抗剂（recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra）对碘乙酸钠（sodium iodoacetate,MIA）诱导的骨关节炎（osteoarthritis,OA）大鼠的治疗作用。方法 将雌性Wistar大鼠根据热痛阈值均衡分为正常对照组（11只）和造模组（55只），造模3 d后，依据左后肢膝关节肿胀率将造模组随机分为溶剂对照模型组（安慰剂）及原料药低（9 mg/kg rhIL-1Ra）、高（18 mg/kg rhIL-1Ra）剂量组，每组12只，均经颈部皮下注射给药，1 mL/kg,1次/d，连续14 d。分别于造模前后3 d及首次给药后2、4、7、14 d，测量左后肢膝关节同一处的直径，计算肿胀度、肿胀率及肿胀抑制率；取左后肢膝关节标本固定，经石蜡包埋、切片后，番红O染色，显微镜下进行病理损伤评分。结果 造模3 d后，除正常对照组外，其他各组大鼠膝关节肿胀率均约达30%；与溶剂对照模型组比较，原料药低剂量组肿胀度和肿胀率在给药后2、4 d(1.52±0.38、1.26±0.43)时均降低（t分别为1.924、1.945,P均<0.05），而原料药高剂量组在给药后2、4、7 d(1.51±0.37、1.15±0.24、1.14±0.39)时均显著降低（t分别为2.976、2.874、2.902,P均<0.01）。与溶剂对照模型组比较，原料药低、高剂量组（8.33±1.86、8.17±2.79）大鼠关节软骨病变程度相似，病理评分统计结果显示有轻微降低（t=1.814,P均> 0.05），造模成功。结论 给药14 d，高剂量rhIL-1Ra能显著减轻MIA诱导的大鼠骨关节炎急性期关节肿胀，但对MIA诱导的慢性骨关节炎的痛觉感受无明显影响，且未见其显著逆转MIA诱导的膝关节软骨损伤。

  2024年09期 v.37 1090-1095页 [查看摘要][在线阅读][下载 896K]
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• 人促红细胞生成素N糖图谱离子色谱分析方法的联合验证

  史新昌;于雷;秦玺;安怡方;李响;周勇;

  目的 对离子色谱（ion chromatography,IC）联用脉冲安培检测器（pulsed amperometric detector,PAD）分析重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）N糖图谱方法进行多实验室联合验证。方法 将rhEPO供试品用25 mmol/L磷酸盐缓冲液超滤置换缓冲体系，调整浓度至2 mg/mL，用糖苷酶F酶切后，经乙醇沉淀，取上清冷冻干燥，获得rhEPO游离N糖。色谱条件：分析柱为Dionex CarboPac PA200，保护柱为Dionex CarboPac PA200；流动相A为50 mmol/L氢氧化钠溶液，流动相B为200 mmol/L氢氧化钠溶液，流动相C为250 mmol/L乙酸钠溶液；进样体积为25μL；流速为0.5 mL/min；柱温为30℃；梯度洗脱；使用仪器自带分析软件进行峰簇最高峰保留时间和峰簇面积百分比积分。选择3家实验室（L1～L3）进行方法的联合验证，包括准确度、精密度、线性、检出限（limit of detection,LOD）和定量限（limit of quantification,LOQ）、稳定性。结果 rhEPO N糖各峰簇清晰可见；3个实验室不同浓度供试品各峰簇面积百分比均在84%～116%之间，方法准确度良好；各峰簇最高峰保留时间RSD均<5%，面积百分比RSD均<10%，方法重现性良好；蛋白浓度在1.0～3.0 mg/mL范围内，线性良好，R2> 0.98;LOD约为0.10 mg/mL,LOQ约为0.32 mg/mL；在2～8℃下存放48 h，稳定性良好。结论 建立了rhEPO N糖图谱IC法，联合验证指标良好，为rhEPO质量标准的提高提供了技术支持。

  2024年09期 v.37 1096-1101+1108页 [查看摘要][在线阅读][下载 883K]
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临床研究

• 40岁以上成人接种不同类型乙型肝炎疫苗的免疫效果及影响因素分析

  赵春艳;孙远洁;石晶;张建明;吴疆;高培;

  目的 分析北京市通州区≥40岁成人接种乙型肝炎（简称乙肝）疫苗（hepatitis B vaccine,HepB）的免疫效果及影响因素，为成人HepB免疫策略提供依据。方法 选取≥40岁通州区常住人口且乙肝5项指标全部阴性者，随机分为3组，按照“0-1-6月”程序分别接种酿酒酵母HepB、汉逊酵母HepB、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）HepB，免疫前及全程免疫后第1、6个月采血，检测乙肝表面抗体（抗-HBs），采用χ~2检验、非参数检验、单因素和多因素Logistic回归分析抗体阳转率及影响因素；通过被动监测方式，收集研究对象接种疫苗后28 d内发生的疑似预防接种异常反应（adverse events following immunization,AEFI）事件。结果 全程接种后1个月，3种疫苗抗-HBs总体阳转率为90.07%，几何平均浓度（geomtric mean concentration,GMC）为206.06 IU/L;6个月后抗-HBs总体阳转率为82.88%,GMC为68.17 IU/L，差异有统计学意义（χ~2=149.42,P <0.001;Z=-11.942,P <0.001）。多因素分析显示，不同疫苗种类是全程接种1、6个月抗-HBs阳转率的影响因素（OR> 1,P <0.05），性别是全程接种6个月抗-HBs阳转率的影响因素（OR> 1,P <0.05）。未收集到AEFI事件报告。结论 40岁以上人群接种HepB 1和6个月后能产生良好的免疫效果，CHO、汉逊酵母组优于酿酒酵母组。应加大宣传力度，积极推广成人HepB接种，降低成人乙肝发病率。

  2024年09期 v.37 1102-1108页 [查看摘要][在线阅读][下载 866K]
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技术方法

• 二代测序技术在Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Vero细胞）生产质量控制中的应用

  李丰茂;罗志宇;邹江龙;喻刚;

  目的 将二代测序（next generation sequencing,NGS）技术应用至Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Vero细胞）（Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,sIPV）生产质量监控中，以期确保疫苗的安全性和批间一致性。方法 将脊髓灰质炎病毒（poliovirus,PV）Sabin株Ⅰ型、Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型工作种子批分别接种至生物反应器微载体培养的单层Vero细胞上，33℃培养3～4 d，获得疫苗代次病毒液，每个型别制备3批。提取各型别工作种子批毒种和疫苗代次病毒液RNA，用NGS技术分析基因突变频率、神经毒力决定位点、突变热点及批间一致性。结果 3种型别PV工作种子批毒种经培养后，Sabin株Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型比Sabin株Ⅰ型更易发生突变，非编码区神经毒力决定位点突变频率明显上升（t=3.21～5.83,P均<0.05），编码区神经毒力决定位点突变频率变化较小（t=1.29～2.34,P均>0.05）或明显下降（t=6.01～9.62,P均<0.05）;Sabin株Ⅱ型毒株的nt869位点及Pfizer株Ⅲ型毒株的nt2 493位点各发生1个突变热点，突变方式均为C→T，其中nt2 493既是神经毒力决定位点，也是突变热点。3种型别各3批疫苗代次病毒液均具有良好的批间一致性，基因组VP1区域各核酸位点突变频率批间拟合R2为0.947～0.995。结论 NGS技术可高效检测sIPV生产过程中PV基因组的突变，且稳定可靠，可用于该疫苗的质量控制。

  2024年09期 v.37 1109-1114+1121页 [查看摘要][在线阅读][下载 935K]
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• 基于ASTM F2131-02标准试验的重组人骨形态发生蛋白-2体外生物活性检测方法的优化及验证

  谢倩;甘琪;俞远满;钱江潮;

  目的 优化基于ASTM F2131-02标准试验的重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)体外生物活性的检测方法，并进行验证。方法 在美国试验材料学会（American Society for Testing Material,ASTM）建立方法的基础上，对检测细胞株（W-20-17及C2C12细胞）、rhBMP-2稀释方式（2及3倍系列稀释）、细胞培养时间（24、36、48、72 h）、细胞冷冻温度（-20及-80℃）进行优化，并验证优化方法的特异性、中间精密性、线性及耐用性。应用优化方法检测不同厂家来源rhBMP-2的比活性。结果 确定采用C2C12细胞作为检测细胞；最佳rhBMP-2稀释方式为2倍系列稀释；最佳细胞培养时间为48 h；最佳细胞冷冻温度为-80℃。rhBMP-2样品中加入杂蛋白（牛血清白蛋白）时，C2C12细胞可特异性响应其中的rhBMP-2诱导作用；2名实验员于2个时间点共12次检测结果的CV为11.7%;rhBMP-2样品的理论效价在70%～142%范围内与实测效价呈良好的线性关系，拟合直线回归方程为：y=0.983 1 x-0.010 3,R~2为0.996 4；采用4、11、21代次C2C12细胞检测rhBMP-2比活性的CV为5.2%。采用优化方法重复2次测定不同厂家来源rhBMP-2样品比活性的CV为1.3%～7.5%。结论 优化的方法具有良好的特异性、中间精密性、线性及耐用性，可用于rhBMP-2体外生物活性的检测，为其研究、生产和应用提供了可靠的分析方法。

  2024年09期 v.37 1115-1121页 [查看摘要][在线阅读][下载 914K]
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• 猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测方法的建立及验证

  于新友;李天芝;张松林;沈志强;

  目的 建立同时检测猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）和非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）2种病原的双重荧光PCR方法，并进行验证及初步应用。方法 根据NCBI中收录的BVDV5'UTR和ASFV VP72基因序列，分别设计1对特异性引物和1条TaqMan探针，建立一种能同时检测BVDV和ASFV的双重荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密性验证。采用建立的方法分别检测猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）活疫苗和猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）活疫苗（76批次）以及添加BVDV和重组质粒pMD-VP72的猪PRV活疫苗（各5瓶）中的BVDV和ASFV，并按照《中华人民共和国兽药典》三部（2020版）和中华人民共和国农业农村部公告第172号规定的方法分别对BVDV和ASFV进行复核检测。结果 建立的双重荧光PCR法最低可检测浓度为4.2拷贝/μL的BVDV重组质粒和浓度为8.7拷贝/μL的ASFV重组质粒；不与其他常见病原体发生交叉反应；重复性和试验间精密性检测的变异系数（CV）均不高于2%。结论 本实验建立的双重荧光PCR方法灵敏度高，特异性强，精密性好，可用于猪用疫苗中外源病毒的快速检测及猪用疫苗等生物制品的质量控制。

  2024年09期 v.37 1122-1126+1132页 [查看摘要][在线阅读][下载 851K]
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• 群体倍增水平评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性

  王朋超;孙志华;崔晓峰;孟丽;尚雪;王夏楚;时琪琪;李玉华;李津;安文珏;潘若文;

  目的 采用群体倍增水平（population doubling level,PDL）评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性，并进行验证，以期为该细胞工业化生产培养提供实验依据。方法 将工作种子批HEK293细胞连续传代60 d，每2 d传1代，评价PDL增加至10～60时的细胞稳定性。通过相关研究结果计算获得当HEK293细胞传代培养至2 500 L规模时，各代PDL应控制在2±0.2范围内。将工作种子批HEK293细胞经摇瓶（125、500、1 000、3 000 mL，共传4代）、细胞扩增系统（cell expansion system,CES）(25、25及50 L，共传3代)、生物反应器（100、500、500，共传3代）阶段培养，各代PDL均控制在2±0.2范围内，共培养3批，并分析细胞密度、活率、结团率、直径等指标。500 L生物反应器培养HEK293细胞72 h，按MOI=5～10接种工作种子批腺病毒，培养2 d，收获病毒培养液，检测病毒颗粒数。结果工作种子批HEK293细胞连续传代至PDL达60时仍能维持较高的细胞密度和活率。将PDL控制在2±0.2范围内，3批HEK293细胞在摇瓶、CES、生物反应器培养阶段的密度均> 2.0×10~6个/mL，活率均> 96%，细胞直径约为17μm；结团率均<35%。3批500 L生物反应器培养的HEK293细胞接毒2 d后，病毒颗粒数分别达11.68×10~(10)、12.55×10~(10)和9.38×10~(10)vp/mL。结论 采用PDL评价HEK293细胞传代稳定性是可行的，可更科学地反映传代细胞的生长状态。

  2024年09期 v.37 1127-1132页 [查看摘要][在线阅读][下载 930K]
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• 基于TaqMan探针非洲猪瘟病毒E301R基因荧光定量PCR检测方法的建立及验证

  葛海亮;张柯慧;于少雄;曹宏伟;李素;杨玉莹;仇华吉;

  目的 建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）E301R基因荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法，并进行验证，以期应用于临床样本中ASFV的检测。方法 通过对ASFV E301R基因序列进行分析，选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针。PCR扩增E301R基因片段，克隆至pCAGGS载体，构建质粒标准品，建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法，并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性。采用建立的方法检测92份临床样本，并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较。另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析。结果 质粒标准品在1.6×（10~1～108）拷贝/μL范围内，与Ct呈良好的线性关系，线性回归方程为：y=-3.239 x+40.774,R2=0.994；重复性及中间精密性验证CV均<2%；除ASFV外，猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）及猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）均未出现扩增曲线；最低可稳定检出1.6×10~1拷贝/μL的质粒标准品；浓度为1.6×10~2和1.6×10~1拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90%～110%之间。建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7%(Kappa=0.932,P=1.000)。E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因。结论 建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性，可用于临床样本中ASFV的检测。

  2024年09期 v.37 1133-1139页 [查看摘要][在线阅读][下载 1110K]
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综述

• 纳米疫苗载体材料的研究进展

  尚金梦;赵静;常亮;翟丽丽;

  疫苗是一种预防传染病和治疗疾病的重要手段。近年，有研究采用分子生物学方法将病原体的多肽蛋白或核酸整合至载体上，构建新型疫苗。其中纳米材料具有生物相容性高、毒性低、抗原装载效率高、靶向性强等优势，已成为纳米疫苗制备中的常用载体。目前，用于制备纳米疫苗的载体材料包括蛋白质/肽、脂质体、聚合物和无机物等，可用于多种疾病相关纳米疫苗的研发及制备。本文就各种纳米疫苗的优势及纳米疫苗载体材料的研究进展作一综述，以期为纳米疫苗的设计、研发及应用提供新的思路和策略。

  2024年09期 v.37 1140-1145+1151页 [查看摘要][在线阅读][下载 856K]
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• 表观遗传修饰在肿瘤细胞周期调控中作用的研究进展

  高娜;郭文杰;刘芳;陈彻;

  正常细胞周期包括细胞分裂、分化、凋亡或焦亡过程，可受多种调节蛋白的调控。特定基因或整个基因组的DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)作用等表观遗传机制在细胞周期过程中发挥重要作用，这些机制的改变使细胞周期失调，导致细胞生长紊乱，引起表观遗传修饰异常，正常细胞可能向肿瘤细胞发展，是人类肿瘤发生的重要原因之一。本文就细胞周期中的表观遗传调控、表观遗传机制与细胞周期调控在肿瘤中的异常、肿瘤细胞周期相关表观遗传调控的治疗靶点作一综述，以期为深入探讨表观遗传机制与细胞周期调控间的相关性及肿瘤的发生机制提供新的思路。

  2024年09期 v.37 1146-1151页 [查看摘要][在线阅读][下载 864K]
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• 《中国生物制品学杂志》稿约

  <正>《中国生物制品学杂志》于1988年创刊，主要报道我国生物制品科技成果及相关行业国内外研究现状和发展动态。本刊为月刊，由国家卫生健康委员会主管，中华预防医学会和长春生物制品研究所主办。1刊载内容和设置栏目主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用及质控类学术文章，并兼顾重大学术交流活动的报道。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。本刊主要设有疫苗研究、基础研究、治疗制剂、诊断制剂、临床研究、技术方法、综述及专题报道等栏目。

  2024年09期 v.37 1152页 [查看摘要][在线阅读][下载 556K]
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